일반기술

한세눌라 폴리모르파 고발현시스템

본 기술은 H. polymorpha 유래의 카르복시펩티다아제, 프로티아제를 코딩하는 유전자 염기서열을 동정하여, 이를 발현하는 유전자를 제거한 벡터를 이용하여, 이들 단백질분해효소가 중복하여 제거된 균주를 개발하는 기술로 이루어져 있다. 이를 통해 앞서 언급한 단백질분해효소 변이주를 숙주세포로 이용하여 카르복시 말단의 분해가 거의 발생하지 않은 변형되지 않은 천연의 외래 단백질 생산방법을 포함하고 있다. H. polymorpha는 P. pastoris와 마찬가지로 glycerol과 같은 배지성분을 이용하여 짧은 발효시간에 고농도의 균체와 단백질 발현 수준을 얻을 수 있다는 장점을 갖고 있을 뿐만 아니라 목적단백질 이외의 숙주세포 유래의 단백질은 거의 배지 중으로 분비하지 않기 때문에 상대적으로 높은 순도의 제품단백질을 얻을 수 있는 장점이 있다. 재조합 S. cerevisiae 시스템에서 번역후 수식과정중 빈번하게 발생하는 hyperglycosylation 또한 크게 문제가 되지 않는다. 재조합 H. polymorpha를 이용하는 생물공정은 주로 methanol oxidase (MOX) promoter나 formate dehydrogenase (FMD) promoter를 사용하게 되는데, 이들 promoter는 P. pastoris와는 달리 메탄올을 주입하지 않고도 상당한 정도의 목적단백질을 발현시킬 수 있는 장점이 있다. 따라서 H. polymorpha는 목적단백질의 발현을 위하여 메탄올 뿐만 아니라 glycerol과 같은 보다 안전한 기질을 사용할 수 있고 P. pastoris처럼 메탄올 농도를 정밀하게 조절해야 하는 번거러움을 피할 수 있는 공정상의 이점이 있다. P. pastoris의 경우 목적단백질 유전자가 homologous recombination에 의하여 염색체의 HIS4부위에 주로 도입되지만 H. polymorpha는 nonhomologous recombination을 통해서 100 copy 이상의 목적단백질 유전자를 도입할 수 있어서 목적단백질의 발현효율이 숙주세포에 존재하는 유전자의 copy number에 크게 의존하는 경우는 P. pastoris와 비교하여 상대적으로 유리하다. 또한 카르복시펩티다아제, 프로티아제가 결핍된 균주를 이용할 수 있으므로 카르복시 말단의 분해가 거의 발생하지 않은 외래 단백질, 예를 들어 hEGF, hPTH, human serum albumin, hirudin 등 유용한 의약용 단백질의 대량 생산이 가능하다. 외래 DNA의 안정적인 다중도입을 위한 혁신적인 ARS(자기복제서열 : HARS36)로서 강력한 항시발현(constitutive) GAP 프로모터를 통해 특정한 유도조건 없이 높은 수준의 발현이 가능하다(MOX promoter에 비해 3배의 생산성). 본 기술을 이용하여 hirudin이외에도 hEGF, human serum albumin, hPTH 발현 시스템이 가능하며, 추가 연구를 통해 산업용 효소의 생산, 기능성 효소의 생산도 가능하다. 카르복실기 말단의 단백질분해 효소가 결여된 호스트시스템으로서 재조합 단백질 수식과정중 hyperglycosylation 현상이 없어 변형되지 않은 본래의 목적 단백질을 얻을 수 있다. 또한 본 기술의 경우 독일 Rhein biotech사와의 cross-licensing을 통해 기술사용에 있어 제한이 없으며 P. pastoris 등에 비해 라이센싱 비용의 부담이 적다는 이점이 있다.