일반기술

바실러스 서브틸리스 ＥＫ11 균주 및 이로부터프로토펙티나아제 제조방법

본 기술은 바실러스 서브틸리스 EK11(Bacillus subtilis EK11) 균주(수탁번호 KCTC 8986P) 및 이로부터 프로토펙티나아제(protopectinase)의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 기술은 바실러스 서브틸리스 IFO12113(Bacillus subtilis IFO12113) 균주를 변이처리하여 얻은 변이균주 바실러스 서브틸리스 EK11(Bacillus subtilis EK11)를 프로토펙티나아제 생산을 위한 최적의 배지에서 배양하여 다량의 프로토펙티나아제를 제조하는 방법에 관한 것이다.식물세포의 형태유지 및 특성에 중요한 역할을 하는 세포벽은 셀룰로오스(cellouse), 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 펙틴(pectin)질 등의 탄수화물로 구성되어 있다. 이들 탄수화물들을 구성하는 단당류는 β-결합으로 연결되어 있어 자연상태에서 대체로 분해되기 힘드나, 이들의 대사에 관여하는 효소들이 발견되어 효소를 이용한 산업적 이용이 가능하여졌다. 식품산업에서의 경우 셀룰라제(cellulase)를 이용한 주류제조공정의 개선, 펙티나아제(pectinase)를 이용한 과즙의 청징화, 세포벽 분해효소 혼합물을 이용한 수용성 고형분 함유식품 제조공정의 효율성 제고 등에 응용되고 있다.펙틴질은 식물조직 중에 다양하게 분포하며 갈락투론산(galacturonic acid)과 메톡실(methoxyl)기로 이루어지는 헤테로폴리사카라이드(heteropolysaccharide)로서 세포벽에서 윤활작용 또는 점착역할을 하는 것으로 알려져 있으며 과실의 숙성, 식품가공에서의 역할, 기능성 식이섬유로의 이용 등이 연구되어 있다. 펙틴(pectin)질은 화학적, 물리적 성상으로 프로토펙틴(protopectin), 펙틴(pectin, pectinate), 펙틴산(pectic acid, pectate) 등으로 나눌수 있으며 서로간에 밀접한 관계를 갖는다.본 기술은 모균주 바실러스 서브틸리스 IFO12113(Bacillus subtilis IFO12113)를 니트로소구아니딘이 함유된 SC 용액(0.15M 염화나트륨, 0.01M 구연산나트륨)으로 변이처리하여 프로토펙티나아제를 생산하는 변이균주 바실러스 서브틸리스 EK11(Bacillus subtilis EK11)(수탁번호 KCTC 8986P)을 제조하는 단계; 상기 변이처리하여 얻은 프로토펙티나아제 생산성 변이균주 바실러스 서브틸리스 EK11( Bacillus subtilis EK11)를 글루코스(glucose), 프럭토스(frutose), 슈크로스(sucrose), 말토스(maltose), 말토덱스트린(maltodextrin), 덱스트린 (dextrin), 갈락토스(galactose), 아라비노스(arabinose), 옥수수전분(corn starch), 감자전분(potato starch), 수용성 감자전분(soluble potato starch)과 같은 탄소원을 각각 포함하는 배지에서 배양하면서 생성된 포자수, 생균수 및 생성된 프로토펙티나아제의 양을 측정하여 변이균주 바실러스 서브틸리스 EK11(Bacillus subtilis EK11)로부터 프로토펙티나아제 생산을 위한 최적의 탄소원을 결정한 후 최적의 탄소원을 각각 다른 양으로 포함한 배지에서 역시 상기와 동일한 방법으로 바실러스 서브틸리스 EK11(Bacillus subtilis EK11)를 배양하고 포자수, 생균수 및 생성된 프로토펙티나아제의 양을 측정하여 프로토펙티나아제 생산을 위한 상기 탄소원의 최적 사용량을 결정하는 단계; 변이균주 바실러스 서브틸리스 EK11(Bacillus subtilis EK11)를 (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, NH4H2PO4, NH4NO3, NaNO3, KNO3, 펩톤, 소이톤, 효모추출물, 콩가루, 트립톤, 카제인과 같은 질소원이 각각 함유된 배지에서 배양하면서 포자수, 생균수 및 생성된 프로토펙티나아제의 양을 측정하여 변이균주 바실러스 서브틸리스 EK11(Bacillus subtilis EK11)로부터 프로토펙티나아제 생산을 위한 최적의 질소원을 결정한 후 최적의 질소원을 각각 다른 양으로 포함한 배지에서 역시 상기와 동일한 방법으로 바실러스 서브틸리스 EK11(Bacillus subtilis EK11)를 배양하고 포자수, 생균수 및 생성된 프로토펙티나아제의 양을 측정하여 프로토펙티나아제 생산을 위한 상기 질소원의 최적 사용량을 결정하는 단계; 상기 결정한 탄소원과 질소원을 최적량으로 포함하는 배지에 CaCl2, MgCl2, BaCl2, NaCl, FeCl3, ZnCl2, SnCl2, NaHAsO4, O-페난트랄린(O-Phenanthraline), NaF와 같은 무기염류를 각각 첨가하고 변이균주 바실러스 서브틸리스 EK11(Bacillus subtilis EK11)를 배양하면서 포자수, 생균수 및 생성된 프로토펙티나아제의 양을 측정하여 프로토펙티나아제 생산에 미치는 무기염류의 영향을 조사하는 단계 및; 상기 단계에서 결정한 최적의 프로토펙티나아제 생산에 적합한 탄소원, 질소원, 무기염류를 포함한 배지에서 본 발명 변이균주 바실러스 서브틸리스 EK11(Bacillus subtilis EK11)를 배양하며 프로토펙티나아제를 제조하는 단계로 구성된다.