일반기술

산소의존형 유도성 프로모터에 의한 단백질의 제조 방법

본 발명은 산소의존형 유도성 프로모터에 의한 단백질의 제조방법에 관한 것으로, nar 프로모터의 발현은 배양초기에 1% 질산염(NaNO3) 존재하에서 대장균을 키우는 것이 최적이었으며, 몰리브데늄염의 농도에는 별 영향이 없었다. 최대의 유도율은 하룻밤 배양액을 발효기에 접종하기 전에 플라스크에서 2.5시간(OD600=1.3 될 때까지) 배양한 경우에 얻어졌다. 단위 세포당 뿐만 아니라, 단위 배지부피당 최대의 베타 유당분해효소는 대장균을 OD600=1.7까지 호기적인 조건(용존산소를 80% 이상)으로 키우다가 용존산소를 1-2%로 낮추어 유도시 킨 경우에 얻어졌다. 이상에서 얻은 최적의 조건에서 회분실험한 결과, 유도 6시간 후에 세포농도는 OD600- 3.2가 되었고, 베타 유당분해효소의 비활성도는 36,000밀러 단위였으며, 유도율은 300이었다. 이것을 SDS- PAGE한 결과 발현된 베타 유당분해효소는 전체 세포단백질의 약 35%에 해당하였다. 본 발명은 산소의존형 유도성 프로모터에 의한단백질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 본 연구에 앞서 염색체상에 정상적인 nar 오페론을 가지고 있는 대장균내에 클로닝되어 있는 nar 프로모터가 들어있는 계(Mv1190/pXR8971)에 대한 특성을 조사한 바 있다(Biotechnology Letters, Accepted, 1995). 이 Mv1190/pXR8971계에서는 대장균내 염색체상의 nar 오페론으로부터 발현된 질산염 환원효소가 질산염을 아질산염으로 변환시키면서 발생시키는 산소에 의해 클로닝된 nar 프로모터로부터의 발현은 억제되었다. 따라서, 본 실험에서는 이 영향을 없애기 위해 염색체상에 비정상적인 nar 오페론을 가지는 대장균에 들어 있는 계에 대해 특성연구를 하였다. 이 비정상적인 nar 오페론은 질산염 환원효소를 이루는 한 소단위가 돌연변이되어 만들어진 것이다(J.Bacteriol., 151, 788-799, 1982).