일반기술

M-CSTA계열 혈전치료제

M-CSTA-P1(Pro-Urokinase; Pro-UK)의 개발 인체신장세포(HEK)를 이용하여 Pro-UK cDNA를 크로닝하였고, CHO세포에서 발현할수 있도록 세포주 MPUK를 제조하였다. 이 세포주를 이용 Pro-UK를 대량생산하는 관류배양공 정과 연속배양으로 얻어진 배양액으로부터 Pro-UK를 대량정제하는 공정을 확립하였다. 이 때 분리정제된 Pro-UK는 비활성도가 약 15만 IU/mg, 수율은 25%이었으며, 물리화학적 특성을 확인하였다. M-CSTA-P2(Salmonase, S-PA)의 개발 Salmonase는 한국산 살모사 독으로부터 분리된 혈전용해제로서, 유전자크로닝을 수행하였다. 살모사 독샘조직으로부터 mRNA를 분리하여 cDNA library를 구축한 후, Salmonase단 백질의 아미노산 분석결과 얻어진 정보를 이용 완전한 cDNA clone을 확인규명하였다. 이 단백질은 234개의 아미노산으로 구성된 신규효소임을 확인하고, E. coli에서 발현연구와 refolding과정을 거쳐 효소활성을 조사하였다. S-PA도 마찬가지 전략으로 유전자 크로닝을 수행하였다. 한국산 지네조직으로부터 cDNA library를 구축하고, 아미노산 분석결과를 이용 PCR primer와 probe를 제조하였다. Screening 결과 partial clone을 확보한 상태이며, full clone을 구축하고자 연구를 진행중에 있다. M-CSTA-P3(Salmobin, Salmosin)의 개발 혈전예방제로 사용될 Salmobin과 Salmosin은 역시 한국산 살모사 독으로부터 순수 분리 되었다. 정제된 Salmobin은 thrombin-like enzyme으로써 분자량이 43kDa이며, Salmosin은 분자량 8 kDa의 polypeptide로서 혈소판 응집억제 작용을 하는 것으로 확인되었다. 이 두 단백질의 물리화학적 성질 및 항혈전활성을 in vitro에서 규명하였다. in vivo활성을 조사하기 위해 이미 구축된 살모사 독샘조직 cDNA library로부터 유전자 cloning을 수행하였다. 그 결과 우선 Salmosin의 전체 cDNA가 크로닝되었고, 아미노산 서열이 확인되었다