일반기술

내열성 Tca DNA중합효소 및 그 제조방법

본 발명은 고온성 균주인 더머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) CK24로부터 유래된 새로운 내열성 DNA 중합효소에 관한 것이며 또한 유전자 재조합 대장균을 이용하여 상기 내열성 DAN 중합효소를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 더머스 칼도필러스 GK24로부터 새로운 내열성 DNA 중합효소를 분리하여 확인한 후 이를 코딩하는 유전자를 클로닝하여 염기 서열을 결정하고 이로부터 상기 단백질의 아미노산 서열을 결정하며 대장균내에서의 발현을 위한 최적화 조건을 구하여 상기 중합효소를 대량으로 제조 및 정제하는 방법에 관한 것이다. DNA 중합효소는 단일 가닥 DNA를 주형으로 하여 뉴클레오티드 삼인을 상보적으로 결합시켜 이중 가닥 DNA의 합성을 촉매하는 효소이다. 이러한 DNA 중합효소는 중온성 균인 대장균을 대상으로 많이 연구되어 왔으며, 이들중 DNA 중합효소 I 는DNA 염기 서열 및 전체 아미노산 서열이 결정되었고, 또한 이 DNA 중합효소 I 의 5'→3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 갖는 아미노 말단 영역을 제거한 클리나우 단편(Klenow fragment)은 삼차구조까지 밝혀진 바 있다(Jocye, C. M. etal., J. Biol, Chem. 257, 1958-1964(1982) ; Jocye, C. M. and Steitz, T. A., Trends Biochem. Sci. 12, 288-292(1987)). 이에 비해 고온성 균주들로부터 생성되는 내열성 DNA 중합효소에 관한 연구는 상대적으로 적었으며, 대표적인 것이 더머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus) YT-1의 Taq DNA 중합효소이다(Lawyer, F. C. et al., J. Bio. Chem. 264, 6427-6347(1989)). 이러한 DNA 중합효소들은 분자 생물학 분야에서 DNA의 염기 서열 결정 및 염기 치환 반응(nick-translation)등 여러 용도로 광범위하게 이용되고 있다. 특히 최근 개발된 DNA 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, 약칭 PCR)은 DNA증폭을 비롯한 각종 유전병 진단에 유용하게 활용되고 있는데, 이 기술의 특징은 55~60℃의 프라이머 어닐링, 72℃에서의DNA 중합 반응 및 94℃에서의 주형 DNA 변성등 세단계 반응과정을 약 30회 정도 반복함으로써 목적 DNA 단편을 증폭시키기 때문에 고온에서 안정한 내열성 DNA 중합효소의 사용이 필수적이다(Erlich, H. A,. PCR Technology, 1989, StocktonPress, New York). 따라서 본 발명은 기존의 Taq DNA 중합효소와의 새로운 내열성 DNA 중합효소를 찾아내고 유전공학 기술에 의한 대량 생산이 가능하게 하여 보다 저렴한 가격으로 상기 효소의 다양한 활용을 가능하게 하는 것을 목적으로 하고 있다.