일반기술

분자생물학적 방법을 이용하여 비피더스 균주를 동정하는 방법

분자생물학적 즉 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 패턴 분석을 이용하여 비피더스 균주를 동정하는 방법이다. 비피더스균은 그람 양성 혐기성균으로서 젖산, 아세트산을 생산함으로써 대장의 pH를 감소시키고 부패균의 성장을 억제하고 암모니아를 NH4+ 형태로 유지하게 함으로써 암모니아의 흡수를 감소시키는 적용을 한다. 최근에 건강에 대한 관심이 커지면서 비피더스균을 낙농제품의 첨가물로 많이 이용하고 있다. 비피더스균의 포도당대사(비피더스 경로)는 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 균주에 대한 마커로 사용되며, 이 경로의 가장 중요한 프럭토스-6-포스포케톨라제 효소는 모든 비피더스균 종에서 발견되고 특성이 잘 연구되어 있다. 따라서 비피더스균의 동정은 프럭토스-6-포스페이트 포스포케톨라제(F6PPK) 분석, 가스 크로마토그래피에 의한 세포 추출물에서의 아세트산과 젖산 분석 및 박막 크로마토그래피 분석에 의해 수행되어 왔다. 그러나 비피더스균을 포함하는 인간 및 동물의 대변 또는 발효된 우유로부터 분리 동정하는 초기 단계에서 시간이 많이 소모되고 민감도와 특이성이 결여된다는 단점이 있다. 최근 분자생물학적 방법이 계통 발생학적 연구와 미생물 동정에 사용되는 데 이 방법에는 G+C 수치의 양과 DNA-DNA 교잡법, RFLP, RAPD(random amplified polymeric DNA) 및 DNA PFGE(pulsed-field gel electrophoresis) 등이 포함된다. 이 중 RFLP 분석은 세균 종들과의 유전적 상관관계를 밝히는데 널리 사용되나 비피더스균주의 경우 이런 분자생물학적 방법을 이용하여 동정하는 방법이 아직 없다. 이에 16s rDNA 유전자의 RFLP 패턴에 따른 DNA 지문에 근거하여 비피더스 균주를 동정하고 분석하였으며, 분자생물학적 방법을 이용한 동정 방법이 종래에 사용되는 탄수화물의 발효 패턴을 이용한 비피더스 균주의 동정방법과 비교하였을 때 시간, 비용이 적게 들고 민감도와 특이성이 우수함을 확인하였다.기존의 탄수화물의 발효패턴을 이용한 동정 방법이 가지고 있던 문제점을 개선하여 시간 및 비용이 적게 들고, 민감도와 특이성이 보다 정확하게 각 균주를 동정할 수 있는 방법이다. 분리된 비피더스균주의 16S rRNA에 대해 상보적인 cDNA를 제조하는 단계, cDNA에 제한효소(EcoRI, HindIII 및 CfoI)를 처리하여 소화시키는 단계 및 소화된 DNA 절편의 패턴을 비교하는 단계로 동정한다. 16S rDNA 유전자의 RFLP 패턴에 따른 DNA지문에 근거한 분석에 바탕을 두고, 간편하고 정확하게 비피더스 균주를 동정할 수 있는 RFLP 방법을 사용하였다.기존의 동정 방법이 가지고 있던 민감도와 특이성의 문제점을 개선하여 보다 정확하게 각 균주를 동정할 수 있고, 한국인에게 가장 적합한 균주로서 야쿠르트 등의 다양한 발효식품에 첨가물로 유용하게 사용할 수 있다.유산균을 이용한 제품으로는 발효유 외에 버터류, 치즈류, 발효음료류, 유산균 함유 식품을 포함하여 2000년 총 9931억의 시장을 형성하고 있으며, 유산균을 이용한 제품으로 의약품 중 유아 및 성인용 정장제가 있고 그 시장규모는 1000억에 이르며, 그에 대한 수요가 기대되고 있다.