일반기술

SMB 크로마토그래피를 이용하여 단백질을 재접힘시키는 방법

SMB 크로마토그래피를 이용하여 단백질 응집체(inclusion body)를 재접힘시키는 방법으로서, 목적 단백질 시료를, 충진제를 충진시킨 SMB(simulated moving bed) 크로마토그래피 컬럼에 로딩하고 재접힘시키며, 재접 힘 버퍼를 컬럼에 주입하여 재접힘된 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 방법이다. 유전자 재조합 기술에 의해 재조합 단백질의 유용 유전자 산물을 대량생산하려고 하나 대장균에서 생산된 재조합 단백질은 활성이 없는 형태로 응집된 응집체로 존재하는 경우가 많다. 응집체란 단백질 접힘이 제대로 되지 못해 올바른 3차구조가 형성되지 않아 생긴 비수용성의 침전물이 균체내에 생성되는 것이다. 이를 해결하기 위한 단순희석법은 희석하는 과정 때문에 커다란 반응기가 있어야 하고 무작위적인 이황화결합이 발생할 수 있는 단점이 있다. 최근 이를 개선한 회분식 크로마토그래피를 이용한 재접힘 방법은 원하는 버퍼 조성으로 치환이 가능하고 재생이 불완전하게 이루어진 단백질 부분과 재접힘 공정에 사용된 계면활성제 제거가 용이한 장점이 있으나 재접힘 효율이 높지 않아 생산량에 제약이 있고 충진제의 활용성, 용매의 량 등 단점 때문에 대량의 응집체로부터 재접힘 단백질 생산이 불가능하다. 한편 연속식 크로마토그래피 방법인 SMB는 효율적 분리를 위해 연속적 향류를 이용하는 이동층 크로마토그래피를 모사한 방법으로 흡착제와 이동상이 서로 반대 방향으로 이송되며 컬럼의 중간부분에서 유입되는 혼합물은 각 성분의 이동속도 차이에 의해 분리가 이루어진다. 두 물질간의 분리도가 좋지 않아도 두 물질의 농도분포 곡선의 양쪽 끝에서만 분리가 된다면 순수한 물질을 얻을 수 있고, 석유화학제품의 정제에서 출발하여 키랄 화합물의 분리에 의한 의약품의 생산 및 생명공학 제품에도 응용되기 시작하였다. 그러나 아직 단백질의 재접힘에 적용된 보고는 없는 실정이다. 이에 SMB 크로마토그래피를 단백질 응집체의 재접힘 공정에 적용하여 연속적으로 재접힘된 단백질을 얻을 수 있음을 확인하였다.단백질 응집체를 SMB 크로마토그래피를 이용하여 재접힘시키는 방법으로서, 회분식 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있는 모든 단백질에 적용이 가능하고, 본 실시예는 환원 및 변성된 라이소자임을 사용하였다. 재접힘 버퍼, 충진제, 운전조건 등을 변화시켜 모든 단백질의 재접힘 방법에 사용할 수 있고, 효율에 영향을 주는 변수로는 유속과 반응온도가 있으며 효율적으로 하기 위해 컬럼내에서의 충분한 체류시간이 요구되고 유속, 작동온도, 충진제, 이동상 조성에 따라 최적화할 수 있다. 본 SMB 크로마토그래피를 이용한 단백질 재접힘 방법은 기존의 회분식 재접힘 방법을 대체할 수 있고 또 단백질 재접힘에 SMB를 사용하면 부분적인 분리만으로 연속적인 재접힘 단백질을 얻을 수 있다.기존 회분식 크로마토그래피를 이용한 방법에 비해 단위 생산량당 적은 량의 충진제를 이용하고 적은 량의 이동상을 사용하여 고농도의 재접힘된 단백질을 얻을 수 있어 농축 등의 후처리 공정에 드는 비용과 충진제, 이동상 비용을 줄여 재접힘 단백질을 연속적으로 얻을 수 있다. 부분적인 분리만으로도 연속적으로 재접힘된 단백질을 얻을 수 있어 적은 비용으로 높은 생산량을 기대할 수 있고 유용 효소의 생산원가 감소에 기여할 수 있다.유용한 단백질의 분리 기술로서 생명공학제품의 생산에 적용될 수 있으며, 부가가치가 높은 생명공학제품의 시장이 성장함에 따라 본 기술 응용도 성장될 것으로 예상된다.