일반기술

펩티드의 제조방법

본 발명은 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하고 이렇게 수득된 단백질 또는 폴리펩티드에서 상기 융합 단백질 또는 폴리펩티드의 시스테인 잔기에서의 펩티드 결합을 분해하는 것을 특징으로 하는 시스테인이 없는 펩티드의 제조방법에 관한 것이다.유전자 재조합 기술을 이용하여 펩티드를 제조하기 위하여는 펩티드가 세포내에서 분해되기 쉬우므로, 주로 융합 단백질 형태로 펩티드를 발현시킨다. 융합 단백질로 부터 목적 펩티드를 분해하는 공지 방법은 시아노겐 브로마이드를 사용하는 화학적 방법(Itakura 일행, Science, 198, 1056(1977)또는 효소 팩터 Xa를 사용하는 효소적 방법(Nagai 일행, Methods in Enzymology, 153, 46(1987))이 있다.선행 기술 방법에 있어서 시아노겐 브로마이드를 사용할때, 메티오닌-함유 펩티드가 제조될 수 없으며 ; 팩터 Xa가 사용될 경우에는 목적 펩티드의 수율이 매우 낮다는 문제점이 발생한다.분해 방법으로서는, 아실 시스테인 결합이 2-니트로-5-티오시아노벤조산에 의해 분해되는 방법이 공지되어 있다(Seikagaku Jikken Koza(생화학실험), 1, Chemistry of Protein, pp. 247 ~ 250, Tokyo Kagaku Dohjin).이러한 상황에서, 본 발명자들은 시아노겐 브로마이드 또는 팩터 Xa를 사용하지 않고 융합 단백질로 부터 목적 단백질을 효율적으로 분해하기 위한 방법을 연구하였으며 N-말단에 시스테인을 갖는 단백질 및 유전자 조작 기술 또는 화학 합성에 의해 N -말단에 연결된 시스테인이 없는 펩티드로 구성된 융합 단백질을 제조하고 융합 단백질을 펩티드 결합을 분해하는 반응을 시킴으로써 목적하는 시스테인이 없는 펩티드를 효율적으로 제조할 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 이 발견을 기초로 하여 더 연구하여 본 발명을 완성하였다.본 방법은 다양한 생활성의 펩티드를 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 의해 제조된 GIP(글루코오즈-의존 인슐린 자극 폴리펩티드)(그의 아미노산 서열을 제2도에 나타낸다) 및 GLPI(7-37)(그의 아미노산 서열을 제3도에 나타낸다)는 생리학적 농도의 글루코오즈의 존재하에 인슐린 분비를 촉진하므로 당뇨병 치료 약품으로서 매우 안정하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 상피소체 호르몬(PTH) 및 N-말단으로부터 34개의 펩티드를 포함하는 그의 활성 단편 PTH(1-34)(그의 아미노산 서열을 제4도에 나타낸다)은 뼈의 대사를 증진시키기 때문에 골다공증의 치료약품으로서 유용하다.본 발명의 방법에 의해 제조된 펩티드를 함유하는 제제는 염, 희석제, 보조제 및 다른 담체, 완충제, 결합제, 계면 활성제 및 다른 생리학적으로 허용 가능한 활성 성분을 함유한다. 비-경구 제제는 살균 수용액, 생리학적으로 허용 가능한 용매내의 현탁액의 앰풀 또는 각각의 사용시 생리학적으로 허용 가능한 희석제와 희석시 순수하게 제조될 수 있는 살균 분말(통상적으로 펩티드 용액을 동결건조함으로써 수득된다)의 앰플로서 공급된다.본 발명의 방법은 목적하는 펩티드를 분해함이 없이 제조할 수 있으므로 제약학적 및 다른 용도에 사용될 수 있는 펩티드를 산업적으로 대량으로 제조하는데 유리하다.본 발명의 일반 구조식(Ⅰ)로 표시되는 인간 PTH(1-34)유도체 펩티드는 골다공증, 상피소체기능 감퇴증, 및 고혈압의 치료제로서 사용될 수 있다. 그의 형태는 주사제, 비기관 흡수제, 경직장 흡수제, 경질 흡수제, 경피 흡수제, 또는 점안제를 포함한다. 특정 경우에 있어서, 경구로 투여될 수도 있다. 펩티드가 치료제로서 사용될 때, 유효량이 사용되어서 포유동물, 특히 인간을 치료한다. 비록 일반적으로 1ng 내지 100㎍/체중kg의 양으로 사용되나, 정확한 양은 당분야 숙련인에 의해 결정될 수 있다.펩티드가 치료제로서 사용될 때, 다른 세균 또는 발열물질을 함유하지 않도록 신중히 정제하여야만 한다.골다공증등의 치료제로서 사용될때, 펩티드는 단독으로 또는 제약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 결합하여 상기 주사제, 비기관 흡수제, 경직장 흡수제, 경질 흡수제, 경피 흡수제 또는 점안제 형태로 비경구 투여될 수 있다.