일반기술

카나마이신 저항성 유전자를 포함하는 rescue cloning용 식물형질전환벡터 pRCV1

본 기술은 카나마이신 저항성 유전자를 포함하는 rescue cloning용 식물형질전환용 벡터 pRCV1에 관한 것으로서, 유용 돌연변이체를 만들어 유전자의 기능을 탐색하는 T-DNA tagging 연구 및 형질전환 작물에서 나타나는 도입된 유전자의 비정상적인 발현 양상을 연구하기 위하여 개발된 본 식물형질전환용 벡터는 선발 마커로 카나마이신 저항성 유전자와 reporter gene을 갖추고 있고, tagging을 위해 이용되는 방법인 rescue cloning과 inverse PCR이 보다 효율적으로 수행될 수 있도록 T-border 내부의 제한효소 사이트, T-border 바깥쪽과 안쪽 부분을 바로 시퀀싱할 수 있는 프라이머 사이트가 각각 고려되어 제작되었기 때문에 전이된 T-DNA 내부의 변이와 식물 genomic DNA를 분리 확보하여 분석할 수 있는 보다 효과적이고 간단한 연구방법을 제공할 수 있으며, 더 나아가 T-DNA가 multiple copy로 전이된 형질전환체의 분석도 가능한 뛰어난 효과가 있다. 본 기술은 식물형질전환용 벡터 중 카나마이신 저항성 유전자(nptII)를 운반하는 pCAMBIA2300에 암피실린 저항성 유전자와 박테리아 복제기점(bacterial replication origin)을 갖고 있는 pBluescriptII KS(+)을 삽입시켜 tagging 용벡터(pRCV1)를 제작하고 tagging할 개체의 genomic DNA를 절단하기 위하여 이용할 제한효소를 결정하는 단계; 클로닝된 벡터(pRCV1)를 맵핑하여 클로닝이 정확하게 됐는지 여부를 확인하고 선택 마커가 벡터 내에 존재하는지 여부를 PCR로 확인하는 단계; pRCV1의 전체 염기서열을 기초로 T-DNA 양쪽 border 바깥쪽과 안쪽을 시퀀싱 할 수 있는 프라이머를 제작하여 제작된 프라이머를 PCR로 증폭하고 염기서열 분석하여 제대로 바깥쪽과 안쪽을 시퀀싱 할 수 있는지 여부를 확인하는 단계; pRCV1을 A.tumefaciens LBA4404내로 삽입하고 삽입된 pRCV1에 선택 마커가 존재하는지 여부를 PCR을 통해 확인하는 단계로 구성된다.