일반기술

참다래궤양병균동정용프로브및프라이머와이를이용한참다래궤양병진단방법

본 발명은 참다래 궤양병균 동정용 프로브(probe)와 프라이머(primer)에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 참다래 궤양병균 병원형 특이적 단편의 염기서열을 결정하여 이를 프로브로한 후 이 염기서열을 기초로 하여 콜로니-PCR법으로 참다래 궤양병균을 동정하기 위한 프라이머 제작 및 이를 이용한 참다래 궤양병 진단에 관한 것이다.1980년대 초부터 우리나라에서 본격적으로 재배되기 시작한 참다래는 도입당시 병 방제가 필요없는 무병과수로 농가에 인식되었다. 그러나 최근 궤양병이 발생하여 일부 과수원을 폐원시킬 만큼 참다래 재배의 가장 큰 제한요인으로 대두되었고 시급히 조기에 방제하지 않으면 안되는 상황이 되었다. 참다래 궤양병은 감염 후 2 ~ 3년간의 잠복기를 거쳐 병징이 나타나는 특수성 때문에 감염초기에는 육안 진단이 불가능하다. 또한 발병후에는 방제가 어렵고, 병원세균의 생리, 생화학적 동정에는 몇 개월이 소요되어 방제시기를 놓치게 된다. 본 발명자들은 참다래 궤양병 병원균의 특이적인 분자 마커를 이용하여 참다래 궤양병균을 생리적으로 동정하고자 연구하였다. 참다래 궤양병균의 생리적 동정은 시간, 노력, 비용이 많이 소요되며 정확성에도 문제가 있었다. 따라서 본 발명자들은 이들 문제점을 보완하고 조기에 병원균을 동정하고자 콜로니-PCR(Colony-PCR)법을 연구하였으며 이에 사용되는 프라이머 및 프로브를 합성하였다. 본 발명의 목적은 참다래 병원균 동정을 위한 프로브와 프라이머를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 참다래 궤양병원균 병원형 특이적 단편의 염기서열을 프로브로 제공하고 이 염기서열의 정보를 기초로하여 프라이머를 제작한 후 콜로니-PCR을 행하므로써 참다래 궤양병을 조기에 간단하고 정확하게 진단하는 방법을 제공함에 있다.본 발명의 상기 목적은 랜덤 프라이머(random primer)를 이용한 RAPD 기술에 의하여 참다래 궤양병원균 병원형 특이적 단편을 선발하고, 클로닝한 후 염기서열을 시퀀싱하여 프로브(probe)화하고 상기 참다래 궤양병균 병원형 특이적 단편의 염기서열 정보를 기초로하여 전진 프라이머(Forward primer) 및 역전사 프라이머(Reverse primer)를 합성한 후 이들 전진프라이머 및 역전사 프라이머를 이용하여 콜로니-PCR을 수행하므로써 달성하였다.본 발명은 참다래 궤양병균(Pseudomonas syringae Pv. actinidiae) 19균주와 속, 종 및 병원형이 상이한 유사세균 10균주들을 RAPD 분석하여 궤양병균 특이적 단편을 검출하고(약 670bp) 이 단편을 pGEM-T 벡터에 삽입하여 대장균을 형질전환시킨 후 배양하여 클로닝하므로써 단편(668bp)을 얻고 이 단편의 염기서열을 결정한 후 프로브로하여 서던 블롯 분석한 결과, 참다래 궤양병균 병원형 특이적 단편을 검출하여 참다래 궤양병균 동정용 프로브임을 확인하고 상기 클로닝한 단편의 염기서열를 기초로 제작한 전진 프라이머(forward primer) 및 역전사 프라이머(reverse primer)로 콜로니-PCR을 행한 결과, 참다래 궤양병을 조기에 간단하고 정확하게 진단하는 뛰어난 효과가 있다.