일반기술

신규한 재조합 아스퍼질러스 엔도이눌리나아제의 유전자, 그 발현벡터 및 그를 이용한 형질전환 미생물

*원리 및 개요본 기술은 이눌린으로부터 올리고 과당을 상업적으로 생산할 수 있는 재조합 엔도이눌리나아제(endoinulinase) 효소의 유전자 염기서열을 제공함에 있다. *중요성 및 독창성1) 이눌린을 분해하여 올리고 과당을 생산하고 이를 새로 재조합하여 아스퍼질러스 엔도이눌리나아제(endoinulinase) 유전자 염기서열에 관해 만들어 낸 것이다.2) 이눌린으로부터 올리고 과당을 만드는 엔도이눌리나아제를 아스퍼질러스 피쿰 ATCC 16882(Aspergillus ficuum ATCC 16882)로부터 만들어 그 클로닝하고 유전자 염기 서열을 결정한다. 3) 이 유전자를 효모 또는 다른 곰팡이에 주입하고 길러내어 재조합 엔도이눌리나아제를 대량으로 드러낸다. 4) 대량으로 드러난 재조합 엔도이눌리나아제는 이눌린으로부터 고순도의 올리고 과당을 생산하는 효과가 있다. 5) 생산된 올리고 과당은 국내 원료자원으로부터 제조가 가능하여 과당 생산가격을 낮추는 뛰어난 효과가 있다.*특징 및 장점1.엔도이눌리나아제(endoinulinase)와 엑소이눌리나아제(exoinulinase)를 함께 분비하는 아스퍼질러스 피쿰 ATCC 16882 (Aspergillus ficuum ATCC 16882)으로부터 만들어진 효소 내부의 아미노산 서열을 분석하는 단계2.분석한 아미노산 서열로부터 만들어진 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고 이 PCR 산물의 유전자 순서를 확인3.그 후 엔도이눌리나아제만을 선택적으로 검출할 수 있는 PCR 프라이머를 다시 제작4.이 PCR 프라이머로 PCR 반응을 실시하여 서던 하이브리드제이션 (Southern hybridization)에서 엔도이눌리나아제를 검사하여 찾아내기 위한 프로브를 제작5.게놈 DNA(genomeic DNA)를 여러 제한 효소로 잘라 제한효소 지도(restriction enzyme map)를 만들어 KpnI 효소가 엔도이눌리나아제 유전자를 가장 적당한 위치에서 자름을 확인6.KpnI 제한효소로 자른 게놈 DNA를 pUC19에 결합시켜 새로운 pINU21 벡터를 합성한 후 E.coli DH5α에 도입하여 생긴 모양과 성질을 전환시켜 엔도이눌리나아제 유전자를 클로닝하는 단계7.E.coli DH5α를 형질전환시켜 재조합 엔도이눌리나아제 유전자를 서브클로닝하는 단계 및 서브클로닝 벡터의 T3와 T7 프라이머와 클로닝 벡터의 M13 및 역전 프라이머(reverse primer)를 이용하여 재조합 엔도이눌리나아제를 순서화하는 단계*효과1) 올리고 과당을 만드는 엔도이눌리나아제를 아스퍼질러스 피쿰(Aspergillus ficuum)으로부터 정제하여 그 유전자를 클로닝하고 유전자 염기 서열을 결정하므로서 이 유전자를 효모 또는 다른 곰팡이에 도입하고 배양하여 재조합 엔도이눌리나아제를 대량 발현시키고 대량 발현된 재조합 엔도이눌리나아제는 이눌린으로부터 고순도의 올리고 과당을 생산하는 효과가 있다.2) 생산된 올리고 과당은 용이하게 수득가능한 원료자원으로부터 제조가 가능하여 과당 생산가격을 낮추는 효과가 있으므로 식품산업상 매우 유용한 발명이다.