일반기술

고복제수의 조절유전자를 포함하는 재조합 스트렙토마이세스 페우세티우스 및 고복제수의 조절유전자를 포함하는 재조합 스트렙토마이세스 페우세티우스 및

고복제수의 조절유전자를 포함하는 재조합 Streptomyces peucetius 와 이의 최적화배지를 이용한 독소루비신(doxorubicin)의 생산성을 증대하는 방법이다. 독소루비신의 생합성 과정에서 중요한 조절유전자가 삽입된 고복제수의 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 재조합 스트렙토마이세스 페우세티우스 및 재조합 스트렙토마이세스 페우세티우스의 옥수수분말, K2HPO4 및 MgSO4를 포함한 최적화 배지를 이용하여 생산성을 증대시키는 기술로서 기존 야생형 균주에 비해 30배 이상 증가시킬 수 있어 산업적으로 유용하게 이용할 수 있다. 독소루비신은 polyketide에 속하는 안트라사이클린계 항생제로 DNA 염기쌍 사이에 들어가 RNA합성을 저해시키고 한가닥의 DNA를 파괴시키는 작용기전으로 유방암, 간암 등의 항암제로 사용되고 있다. 생산수율이 높은 daunorubicin을 미생물 발효공정으로 생산, 분리하고 화학반응으로 독소루비신으로 전환시켜 생산하나, 공정이 복잡하고 번거로우며 생산비용이 많이 소요된다. 또 스트렙토마이세스 페우세티우스를 이용한 합성법은 복잡하고, 분자유전학적 생합성 조절기작 때문에 수율이 적은 어려움이 있다. 또한 배지조성의 최적화, 순환 무작위 돌연변이 유발로 생산성 향상 노력에도 불구하고, 스트렙토마이세스 페우세티우스의 분자유전학적 배경이 고려되지 않아 만족할 만한 수율로 생산할 수 없었다. 독소루비신의 생합성에 관여하는 조절유전자를 포함한 발현 플라스미드를 제조하고, 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 재조합 스트렙토마이세스 페우세티우스를 제조하며, 이를 최적화 배지에서 배양한 다음 생산된 독소루비신을 분리 정제하여 생산하는 것이다. 즉 독소루비신의 생합성에 관여하는 조절유전자(dnrI)를 고복제수의 플라스미드(pESK402)에 삽입하여 이를 스트렙토마이세스 페우세티우스에서 과발현시켜 균주의 최적배양조건을 갖는 배지에서 배양하여 생산성을 증대시켰다. 따라서 독소루비신의 생합성 경로에 영향을 미치는 조절유전자를 고복제수의 발현 플라스미드에 클로닝하고 재조합 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 재조합 스트렙토마이세스 페우세티우스를 제조하였으며, 최적의 배지조건에서 배양할 경우 30배 이상 증가됨을 확인하고 생산성 증대방법을 확보하였다.스트렙토마이세스 페우세티우스 균주로 독소루비신을 생합성하는 데에 관여하는 조절유전자(dnrI)는 카테콜 프로모터에 의해 발현되는 발현 플라스미드로서 고복제수인 것을 특징으로 한다. 또한 발현 플라스미드는 카테콜 프로모터 하에 dnrI 조절유전자가 삽입된 고복제수의 pESK402로서, 이에 의해 형질전환된 재조합 스트렙토마이세스 페우세티우스 ATCC27952/pESK402이며, 최적화배지는 옥수수분말, K2HPO4 및 MgSO4를 포함한다. 재조합 스트렙토마이세스 페우세티우스와 이의 최적화 배지를 통해 독소루비신을 생산함으로써 야생형 균주와 비교하여 생산량을 30배 이상 증가시킬 수 있다. 국내 10대 항암제가 차지하는 시장은 '03년 1,149억으로 전체 항암제 추정 시장의 약 40.7%를 차지하며, 10대 제품의 '04년 시장규모는 1,521억으로 '03년 대비 약 32% 증가하였으며 전체 시장의 약 43.0%를 차지한다. 이는 글리벡, 엘록사틴 및 신규로 10대 항암제에 진입한 아스트라사의 이레사 제품의 급격한 매출증대에 의한 것으로 분석된다. 따라서 ‘04년의 국내 항암제 시장은 3,500억 정도이다. 현재까지는 화학요법제인 세포독성제가 차지하는 비중과 성장률이 가장 높으나, 해외와 마찬가지로 향후 이 비중은 점차 낮아질 것으로 보인다. 본 기술은 항암제로 이미 사용되고 있는 독소루비신의 생산성을 증대시킨 기술로서 배양설비를 갖춘 GMP설비에서의 제조생산에는 어려움이 없을 것으로 판단되나, 본 기술로 생산된 독소루비신과 기존 독소루비신과의 생물학적 동등성시험을 거쳐 최종 제품으로 사업화하는 것이 요구된다. 이미 제품화되고 있는 독소루비신의 생산효율을 30배 이상 증대시키는 점에서 생산원가절감에 따른 것으로 차별화전략으로 경쟁할 수 있을 것으로 예상된다.