일반기술

AIDS 진단시약 및 면역결핍 바이러스 항원단백질을 제조하는 방법

특허번호 10-0166344는 후천성 면역결핍증(AIDS)을 일으키는 사람의 면역 결핍 바이러스 타입 1(HIV-1)의 항원단백질 p24를 제조하는 방법에 관한 것으로, AIDS의 진단에는 유전자 재조합기술로 대장균에서 생산된 HIV-1 항원, 예를 들어 gp41, gag(p15-p24-p17)또는 gag 등의 항원단백질을 사용하였다. HIV-1 바이러스에 감염되어 1주일이 경과하면 p24에 대한 항체가 유발되므로, 조기진단용 항원으로 p24가 선정되었으나 p24를 유전자 재조합기술로 제조하면 대부분 융합단백질 형태로 회수되며, 융합단백질 부분이 위양성을 일으키는 단점이 있다. 또한 최근 혈액응고인자 Xa(Ellinger et al., Virol. 180, 811(1991))과 스타필로코커스의 단백질 A(Marcz inovits et al., J. Biochem. 31, 225 (1993)에 융합시켜 특이성은 99.5% 수준으로 높아졌으나 제조비용이 비싼 단점이 있다. 즉 p24를 AIDS 진단용 항원으로 유용하게 사용하기 위해서는 고순도의 단백질을 저렴한 가격으로 생산하는 것이 절실히 요구되며, 따라서 본 기술은 대장균에서 발현된 p24를 손쉽게 고순도로 정제하는 방법을 소개하였다. 특허번호 10-0201760은 후천성 면역결핍증(AIDS)을 일으키는 사람의 면역결핍 바이러스 타입 HIV-1에서 강한 항원성을 나타내는 항원인 지피 gp41과 지에이지 gag3단백질의 유전자를 대장균내에서 발현시킨 후에 신속하면서도 용이하게 고순도로 정제하여 민감도와 특이성이 높은 HIV-1항원 단백질 gp41 및 gag3을 제조하는 방법에 관한 것이다. 특허번호 10-0162020은 폴리클론 항체를 포함하는 AIDS 바이러스 진단시약에 관한 것으로, 구체적으로는 엘리자법으로 AIDS 바이러스를 진단함에 있어 하나의 폴리클론항체와 하나의 단일클론항체를 사용하는 진단시약에 관한 것으로, 즉 본 제조 방법은 AIDS 바이러스 진단에 일반적으로 사용되고 있는 엘리자법과 한단계 진단법(one-step sandwich ELISA)의 문제점을 개선하기 위하여 종래의 한단계 진단법에서 단일클론항체대신 폴리클론항체를 사용하므로 매우 경제적이고 간편하게 제조할 수 있는 진단시약에 관한 것이다.특허번호 10-0166344의 제조방법은 먼저 HIV-1의 항원 단백질 p24를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터에 의해 형질전환된 대장균을 배양하여 상기 유전자를 발현시킨다. p24가 발현된 대장균은 초음파 등 통상의 방법으로 파쇄하여 세포 추출물을 만든 후 이를 원심분리하여 봉입체(inclusion body)를 회수하여 세척한 후 완충액에 분산시키는데, 예를 들면 요소가 4M 농도로 포함된 트리스 완충액으로 세척한 후 요소가 8M 농도로 포함된 트리스 완충액에 분산시킨다. 대장균에서 생성된 p24가 다른 단백질과 융합된 형태일 경우, 융합된 단백질을 제거하여 순수한 p24만을 수득하는 것이 필요한데, 예를 들면 분산액에 화학적 단백질 절단제인 히드록실아민을 전체 농도가 약 2M이 되도록 첨가하여 35 내지 45℃에서 3 내지 5시간동안 처리한 다음 산(예를 들면 개미산)을 첨가하여 pH를 2 내지 3으로 조절하여 반응을 정지시킨 후, 투석막을 이용하여 증류수로 투석한다. 이렇게 얻은 조 p24 용액을 분산 완충액에 녹여 이온 교환수지 컬럼을 통과시킨 후 흡착되지 않은 분획들을 수집하여 필요한 경우 한외여과 방법 등으로 농축한 다음 겔 여과 크로마토그래피로 더욱 정제한다. 본 기술의 정제 방법으로 얻은 p24을 이용할 경우 위양성 반응이 없는 AIDS 진단을 할 수 있다.- 특허번호 10-0201760은 HIV-1 항원 단백질 gp41 또는 gag3을 코딩하는 유전자와 적당한 프로모터 및 융합단백질 유전자를 포함하는 발현 벡터에 의해 형질전환된 대장균으로부터 형질 발현에 의해 융합 단백질과 gp41 또는 gag3을 포함하는 인크루전 바디를 생산한 다음, 이 인크루전 바디를 하이드록실아민으로 gag3을 유리시키고, EDAE-세파로즈 컬럼에서 비 gp41 단백질 또는 비 gag3 단백질을 흡착시킴으로써 gp41 또는 gag3단백질을 순수하게 분리하는 단계를 포함하는 재조합 HIV-1 항원의 제조방법을 제공한다.- 특허번호 10-0162020은 모노클론항체 대신 폴리클론항체를 사용함으로서, 진단시약의 제조시 특정한 단일클론항체를 선별하고 까다로운 과정과, 각 클론을 따로따로 배양하는 과정이 생략되므로 매우 간단하고 경제적으로 진단시약을 제조할 수 있는 우수한 효과를 가지고 있다.