일반기술

단백질간의 상호 결합을 조사할 수 있는 이중 라이브러리단백질 결합 검색 방법에 의한 검색 방법 및 이에 이용되는 재조합 효모 균주

본 기술은 라이브러리 차원에서 단백질간의 상호 결합을 조사할 수 있는 이중 라이브러리 단백질 결합 검색 방법 (Double Library Two-Hybrid System) 및 이에 이용되는 재조합 효모 균주에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 효모를 이용한 기존의 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템을 발전시킨 것으로 이중 라이브러리 단백질 결합 검색 방법 (double library two-hybrid system: DLTS)에 의한 검색 방법 및 이에 이용되는 재조합 효모 균주들에 관한 것이다.본 기술은 HF7c 효모의 URA3 유전자의 뉴클레오타이드의 일부가 제거된 재조합 효모 균주 및 476 효모의 URA3의 코딩 부위와 그 상위 부위 사이에 GAL1 프로모터를 끼어 들어가도록 하여 URA3의 발현이 Gal4p에 의존하도록 유전자를 재조합한 효모 균주를 제공하고 상기 효모 균주들을 이용한 이중 라이브러리 단백질 결합 검색 방법에 의한 검색 방법을 제공한다.본 기술은 a) 효모 균주 내의 URA3을 파괴하여 a 타입 균주를 제조한 후, URA3이 GAL1 프로모터에 의해 발현되는 플라스미드를 도입하는 단계, b) 유전자 재조합 방법을 이용하여 효모 균주 내의 URA3이 GAL1 프로모터에 의해 발현되도록 직접 수정하여 α타입 균주를 제조하는 단계, c) 상기 제조된 a 타입 균주 및 α타입 균주에 베이트(bait) 라이브러리 및 프레이(prey) 라이브러리를 각각 형질 전환하는 단계, d) 상기 형질 전환된 a 타입 균주 및 α타입 균주를 각각 5-FOA(5- fluoroorotic acid)를 포함하는 배지에서 배양하면서 가짜 양성 반응을 선택적으로 제거하는 단계, e) 및, 상기 선택 과정에서 살아 남은 두 타입의 형질전환 효모를 메이팅(mating) 시켜 단백질-단백질 결합 쌍들을 검출하는 단계를 포함하는, 이중 라이브러리 단백질 결합 검색 방법을 제공한다. 상기 a) 및 b)와 같이 재조합 효모를 사용하는 이유는 URA3이 Gal4p에 의존적으로 발현되게 하기 위함이다.본 기술에 따르면 단일 단백질이 아닌, 라이브러리 수준의 단백질들의 결합 쌍들을 동시에 효율적으로 검색하기 위한 시스템을 제공할 수 있다.