일반기술

면역형광법을 이용한 탄저 치사독소 활성검정법

본 발명은 치사독소의 기질인 MEK1 (full-length cDNA)을 subcloning 하여 fusion protein 의 형태로 과량발현 시킨 뒤 이를 특정한 방향으로 결합할 수 있게끔 capture ligand 가 처리된 plate를 준비하여 고정시켜 치사요소에 대한High-throughput assay system을 확보하였다. 본assay system 은 기질과 치사요소사이의 특이적 결합 및 cleavage efficiency를 고려한 방식으로 다양한 mechanism 의 inhibitor screening을 가능하게 할 것으로 판단되어진다.탄저균의 높은 위험성은 균주가 가지는 독소 가운데 치사요소(lethal factor)에 의한것임이 널리 보고되어져 있다. 탄저 (anthrax)는 그람 양성 간균인 탄저균(Bacillus anthracis)에 의하여 주로 가축에게 감염되나 사람에게도 발병하는 인수 공통 감염성 질환으로 근래 미국의 경우에서 볼수 있는 것처럼 생물학적 무기로써 이용 될 수 있음음 보여 주었다. 국내에서는 1994년 경주, 1995년 홍성, 및 2000년 창녕에서 발생하였으며, 폐사우의 식육을 섭취함으로서 사람에게도 발병하였음. 특히, 2000년 창녕의 경우, 폐사우를 취급하던 사람에 피부탄저까지 발생하였음. 이는, 탄저에 의한 위험이 가축을 사육하는 농가에서 사람의 생명까지 위협할 수 있는 수준임을 입증하며, 탄저에 대한 방제의 필요성이 대두되었다. 특히 국내에서는 탄저가 산발적으로 일어나기 때문에 많은 가축을 대상으로 예방 접종을 실시하는 것은 비경제적이므로 탄저 다발 지역에 주로 예방 접종을 시도함. 또한, 지금 사용 중인 백신은 병원성이 높아 감수성이 높은 가축이나 사람에게는 사용하기가 곤란함. 이러한 이유로 탄저가 다시 발생할 가능성이 높다 할수 있을것이다. 그러나 현재까지 탄저에 대한 치료제가 없는 실정이며 탄저에 대한 백신 (실험균주를 이용한 vaccinization)이 그나마 유일한 방편이나 여러 가지 위험성이 많아 여러나라가 이에 대한 백신과 치료제 개발에 참여하고 있다. 본 연구진이 개발한 치사요소의 활성 측정을 위한 High-throughput assay system 은 치사요소에 대한 억제제 개발을 위한 가장 필수적이며 핵심적인 tool 이라 할수 있다. 현재까지 개발되어진 방법과는 다른 방법의 assay screening (기존의 방식은 기질의 절단부위를 바탕으로한 짧은 fluorecence labeled peptide를 사용하였으나 근래 절단부위와는 다른 기질부위가 치사요소와 기질사이의 특이적 반응성 및 cleavage effieciency를 결정하는 요소임이 밝혀짐)을 이용함으로써 native structure를 가진 기질과 치사요소를 이용한 assay를 가능하게 하였다. 또한 개발한 assay system 과 본 연구진이 그동안 연구해온 치사요소의 특성분석시 사용하여 온 직접적인 assay 방법 (SDS/PAGE) 와 비교하여 본 다양한 실례 실험에서 완벽한 일치성을 보임으로써inhibitor screening 함에 최적의 조건을 갖춘 것으로 사료되어진다.