일반기술

신규한 아스퍼질러스 오리재 파이루베이트 디카르복실라제유전자의 프로모터, 그 재조합 플라스미드 및 형질전환된미생물

○ 기술발명의 목적: 상기 균주를 이용하여 아스퍼질러스 오리재의 유용한 재조합단백질의 생산방법을 제공○ 기술 요약 및 특징: 본 발명은 장류 제조 및 효소 생산 등의 식품산업에 사용되는 균주인 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)의 파이루베이트 디카르복실라제(pyruvate decarboxylase) 유전자의 프로모터 부분의 유전자 염기서열에 관한 것으로서 아스퍼질러스 오리재의 영양생식 세포에서 가장 많이 발현되는 것으로 분석된 파이루베이트 디카르복실라제 유전자를 아스퍼질러스 오리재 ATCC 22788로부터 분리하고 염기서열을 분석함으로써 이 유전자의 프로모터 부분을 특성화하였고 분리된 프로모터를 이용하여 아스퍼질러스 오리재 및 다른 곰팡이에서 유용단백질의 발현을 높히고 생산성을 향상할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.○ 색인어: 아스퍼질러스 오리재, 파이루베이트 디카르복실라제 프로모터본 발명은 아스퍼질러스 오리재의 게놈 DNA로부터 유전자 은행을 제작하는 단계; 아스퍼질러스 오리재의 영양생식세포에서 만든 유전자표지 (Gene Signature)중 다량으로 발견된 파이루베이트 디카르복실라제 유전자 표지를 프로브(probe)로 사용하여 아스퍼질러스 오리재의 유전자은행을 선별하는 단계; 선별된 클론으로부터 파이루베이트 디카르복실라제 유전자의 프로모터부분을 분리하는 단계; 분리된 프로모터의 세기를 검증하는 단계로 구성된다.이하, 본 발명의 파이루베이트 디카르복실라제 유전자의 프로모터부분의 염기서열을 밝히기 위한 구체적인 방법은 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명의 권리 범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.실시예1:아스퍼질러스 오리재 파이루베이트 디카르복실라제(Pyruvate decarboxylase) 유전자의 프로모터부분의 분리 아스퍼질러스 오리재에서 다량 발현되는 파이루베이트 디카르복실라제 유전자의 유전자 표지가 Hwang 등(Hwang, H.-A., Lee, D. W., Kim, J. H., Lee, T. K., Yang, M. S., and Chae, K.-S. (1998) Quantitative analysis of expressed genes inAspergillus oryzaeby sequencing 3'-directed cDNA clones, J. Microbiol. 36: 111-117)에 의해 발표되었다. 따라서 밝혀진 유전자 표지(GS)를 random prime labelling의 방법에 의해 방사성 동위원소 α- 32P-dCTP로 표지(labelling)하고 아스퍼질러스 오리재의 게놈 DNA를 여러 가지의 제한효소로 절단한 후 서던 블럿 하이브리제이션(Southern blot hybridization)방법에 의해 2.5 kbHindⅢ DNA절편에 파이루베이트 디카르복실라제 유전자가 위치함을 알아내었다. 따라서 아스퍼질러스 오리재의 게놈DNA로부터 pUC19 벡터(vector)에HindⅢ 제한효소를 사용하여 유전자 은행을 만들고 위에서 사용한 표지(probe)를 사용하여 파이루베이트 디카르복실라제 유전자가 포함된 2.5 kb의HindⅢ DNA절편을 갖는 클론을 찾아내었다. 이HindⅢ 절편을 염기서열 결정에 의해 확인하였으나 프로모터 부분이 완전히 포함되지 않았으므로, 위와 같은 방법에 의해 파이루베이트 디카르복실라제 유전자의 프로모터 부분이HindⅢ 절편의 처음 253 bp에 위치한EcoRⅤ로부터 위쪽(upstream)으로 1.2 kb의EcoRⅤ 절편에 위치함을 확인하였다.