일반기술

M-CSTA계열 혈전치료제

1) M-CSTA-P1(Pro-Urokinase; Pro-UK)의 개발 인체신장세포(HEK)를 이용하여 Pro-UK cDNA를 크로닝하였고, CHO세포에서 발현할수 있도록 세포주 MPUK를 제조하였다. 이 세포주를 이용 Pro-UK를 대량생산하는 관류배양공 정과 연속배양으로 얻어진 배양액으로부터 Pro-UK를 대량정제하는 공정을 확립하였다. 이 때 분리정제된 Pro-UK는 비활성도가 약 15만 IU/mg, 수율은 25%이었으며, 물리화학적 특성을 확인하였다. 2) M-CSTA-P2(Salmonase, S-PA)의 개발 Salmonase는 한국산 살모사 독으로부터 분리된 혈전용해제로서, 유전자크로닝을 수행하였다. 살모사 독샘조직으로부터 mRNA를 분리하여 cDNA library를 구축한 후, Salmonase단 백질의 아미노산 분석결과 얻어진 정보를 이용 완전한 cDNA clone을 확인규명하였다. 이 단백질은 234개의 아미노산으로 구성된 신규효소임을 확인하고, E. coli에서 발현연구와 refolding과정을 거쳐 효소활성을 조사하였다. S-PA도 마찬가지 전략으로 유전자 크로닝을 수행하였다. 한국산 지네조직으로부터 cDNA library를 구축하고, 아미노산 분석결과를 이용 PCR primer와 probe를 제조하였다. Screening 결과 partial clone을 확보한 상태이며, full clone을 구축하고자 연구를 진행중에 있다. 3) M-CSTA-P3(Salmobin, Salmosin)의 개발 혈전예방제로 사용될 Salmobin과 Salmosin은 역시 한국산 살모사 독으로부터 순수 분리 되었다. 정제된 Salmobin은 thrombin-like enzyme으로써 분자량이 43kDa이며, Salmosin은 분자량 8 kDa의 polypeptide로서 혈소판 응집억제 작용을 하는 것으로 확인되었다. 이 두 단백질의 물리화학적 성질 및 항혈전활성을 in vitro에서 규명하였다. in vivo활성을 조사하기 위해 이미 구축된 살모사 독샘조직 cDNA library로부터 유전자 cloning을 수행하였다. 그 결과 우선 Salmosin의 전체 cDNA가 크로닝되었고, 아미노산 서열이 확인되었다.