일반기술

HIV RNA를 선별적으로 인지하여 분해할 수 있는 NC-RNase

1. 기술의 개요 항HIV 제제 개발을 위해 HIV의 nucleocapsid (NC) 단백질과 숙주 세포에 대한 부작용이 적은 RNase를 이용하여 capsid-targeted viral inactivation (CTVI)을 통해 viral RNA genome에 대한 선택적 파괴력이 우수한 chimeric fusion protein의 개발- Targeting moiety인 NC와 destruction moiety인 RNase를 사용하는 다양한 형태의 fusion protein을 제작하기 위해 Two-step PCR 기법을 사용한다. 먼저 chimeric fusion protein을 구성하는 앞부분 유전자(target gene 1)와 뒷부분 유전자(target gene 2)를 PCR을 이용하여 확보하는 과정에서 Primer 1b는 target gene 2의 전방 말단 부위와, 그리고 primer 1c는 target gene 1의 후방 말단 부위와 homology를 갖도록 제작한다. target gene 1과 2를 포함하는 PCR product로부터 primer를 제거하고 증폭된 두 gene을 혼합한 후, 다시 9 cycle 의 PCR을 통해 chimeric fusion protein의 template DNA를 합성하고 마지막으로 최종 fusion protein의 제작을 위해 primer 1a와 1d를 사용하는 PCR을 통해 target gene 1 과 2의 fusion protein을 완성한다.- Two-step PCR을 통해 증폭된 chimeric fusion protein 유전자를 특정 제한 효소로 처리하여 분리한 후, 동일 제한 효소로 처리된 pQE31 vector에 in-frame으로 클로닝하였다.- chimeric fusion protein의 선택적 반응 기질로서 HIV psi서열 coding 유전자와 이에 대한 대조군으로서 psi 서열과 비슷한 크기로 유전자 조작된 동물세포 유래의 inducible TGF-β (Hisβㆍb) 유전자를 확보하며 RNA 합성을 위한 in vtro transcription을 위해 두 유전자 공히 T7 promoter의 조절 하에 위피하도록 조작한다.2. 기술의 특징 virus 구조 단백질에 nuclease가 결합된 chimera를 목적 세포 내로 주입하거나 발현시킴으로써 정상적인 virion 구성 요소들과 함께 packaging 되어 nuclease를 함유한 virion입자의 생산을 유도하는 방법으로 virus 증식을 억제하는 capsid-targeted viral inactivation (CTVI) 기술은 기존의 virus life cycle의 주요 단백질에 대한 저해제를 탐색하는 방법과 비해 선택성과 파괴력에서 월등한 역가를 갖고 있다. 특히, NC에 fusion 시킬 nuclease의 종류와 역가를 조절하여 숙주세포에 대한 영향을 최소화시킬 수 있다면 HIV 뿐만 아니라 다른 병원성 retrovirus의 억제에도 효과적으로 사용될 수 있는 기반기술을 제공할 수 있으리라 사료된다.