일반기술

꼼치 알 유래의 단백분해효소 저해제의 분리방법

해당 기술은 꼼치 알 유래의 단백분해효소 저해제의 분리방법에 관한 것으로, 꼼치 알의 조추출물을 얻고 이를 이온 교환이나 겔 투과 크로마토그래피를 통해서 여러 단계로 분리하지 않고 CNBr-활성화 세파로즈 4B-파파인 친화 컬럼을 가지고 단일 단계로 분리ㆍ정제함으로써 정제에 필요한 시간을 줄이고 더 높은 수율을 가져오는 분리방법을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 상기와 같이 분리 및 정제된 단백분해효소 저해제를 이용함으로써 수리미 겔화 과정에서 어육의 품질 저하를 발생시킬 수 있는 내열성 단백분해효소를 효과적으로 저해시킬 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있다. □ 기술내용꼼치 알을 50MM NACL, 1 MM EDTA 및 1 MM 2-머켑토에탄올을 포함하는 PH 7.0의 25MM 인산화나트륨 완충용액 A에 첨가하여 균질화시키는 단계;상기 단계의 용액을 원심분리하여 균질 현탁액을 제거하는 단계;상청액을 80℃에서 10분 동안 배양한 후 실온으로 냉각하여 10,000G에서 25분 동안 다시 원심분리하는 단계;상기 추출물을 암모늄 설파이트를 이용하여 분획하는 단계;침전된 분획을 상기 완충용액 A에 녹인 후, 50 MM NACL, 1 MM EDTA, 및 1 MM 2-머켑토에탄올을 포함하는 PH 5.5의 50 MM 아세트산 나트륨 완충용액 B를 이용하여 밤새도록 투석하는 단계;투석된 분획을 완충용액 B로 평형을 유지하고 있는 CM 세파로즈 컬럼에 넣고 PH 5.5의 아세트산 나트륨 완충용액에 NACL을 0 내지 1M까지 직선농도구배적으로 처리하여 1 ML/MIN의 유속으로 컬럼에 처리하여 단백질들을 용출시키는 단계;최고 피크 활성의 50%보다 큰 분획들은 모아서 0.15 M NACL, 1 MM EDTA, 및 1 MM 2-머켑토에탄올을 포함하는 PH 7.5의 25 MM 인산화 나트륨 완충용액 C로 투석하는 단계;모아진 분획들을 10-KDA 막을 사용하여 한외여과함으로써 농축하는 단계;상기 농축물을 완충용액 C로 평형을 유지하고 있는 세파크릴 컬럼에 넣어 0.2 ML/MIN의 유속으로 용출시킴으로써 꼼치 알의 조추출물을 얻는 단계;CNBR-활성화 세파로즈 4B 컬럼의 7G 엘리키트(ALIQUOT)를 세척한 다음 1 MM HCL를 사용하여 글래스 필터 상에서 다시 부풀리는 단계;1M NAHCO3 및 0.5M NACL을 포함하는 PH 8.3의 커플링 완충용액에 파파인(PAPAIN)을 5 MG/ML 농도로 녹인 용액 20 ML를 상기 단계의 겔과 혼합하여 4℃에서 밤새도록 교반하는 단계;상기 겔을 0.2M 글리신을 포함하는 PH 8.0의 블로킹제(BLOCKING AGENT)에 넣어 4℃에서 밤새도록 교반하는 단계;상기 겔을 0.5 M NACL를 포함하는 PH 4.0의 0.1 M 아세테이트 완충용액으로 세척하고 그 다음에는 상기 커플링 완충용액으로 세척하는 단계;상기 겔을 컬럼에 부어 넣어 완충용액 A로 평형을 유지하게 하는 단계;꼼치 알의 조추출물 50ML 엘리키트를 상기 친화 크로마토그래피에 넣어 완충용액 A로 세척하는 단계; 및50 MM NACL을 포함하는 PH 10의 50 MM 인산화 삼나트륨 완충용액을 0.3 ML/MIN의 유속으로 처리함으로써 단백분해효소 저해제를 용출시키는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 꼼치 알로부터 단백분해효소 저해제를 분리하는 방법.