일반기술

형질전환효모 한세눌라 폴리모르파를 이용한 인간혈청 알부민의 제조방법

효모 한세눌라 폴리모르파에서 재조합 인간 혈청 알부민을 효율적으로 대량 생산하기 위한, 고효율 알부민 발현벡터 조립 및 이를 함유한 형질전환체의 제조 및 배양방법에 관한 것이다.본 기술에서는 메탄올 자화효모로서 높은 생산성 및 고농도 배양의 장점으로 인해 새로운 재조합 단백질 발현 시스템으로 각광을 받고 있는 효모 한세눌라 폴리모르파를 숙주로 하여 분비 발현율이 우수한 재조합 알부민 발현 벡터를 개발하고, 이 벡터들이 도입된 형질전환주의 선별 및 고효율 발현주의 선별을 통해 인간 혈청알부민을 제조하는 방법을 제공하자 하였다..따라서 본 기술은 메탄올 자화효모 한세눌라 폴리모르파를 숙주세포로 하여 인간 혈청 알부민을 발현시키는 데 적합한 발현벡터들을 조립하는 과정과 상기 발현벡터를 함유한 효모 형질전환체 선별, 이로부터 고효율 발현주를 선별하는 과정 및 고효율 발현주로부터 인간 혈청 알부민을 제조하는 방법으로 구성된다. 본 기술에 따르면 조립된 HSA 발현벡터로 형질전환시킨 고효율 생산 변이주에서 선별된 재조합 한세눌라 폴리모르파 변이주를 메탄올이 함유된 배지에서 배양시켜, 발현분비된 재조합 인간 혈청알부민을 대량으로 생산할 수 있으므로, 알부민의 수요가 급증하고 있는 의약산업상 매우 유용한 기술이 될 것이다인간 혈청알부민 (HSA)은 585개의 아미노산으로 이루어진 분자량 66.6 kDa 크기의 단백질이다. 혈장 단백질 함량의 약 60%를 차지하는 알부민은 혈장의 삼투압을 유지하는 역할과 더불어 지방산, 담즙 색소, 아미노산, 스테로이드 호르몬, 금속 이온들을 운반하는 역할을 한다. 알부민은 혈장확장액의 대체용액으로 또는 출혈시 혈액보충액으로 사용되고 있어 의료학적으로 그 수요량이 크게 증가하고 있다. 현재까지 인간 혈청알부민은 혈액으로부터 분리 정제한 것을 주로 사용하고 있으나, 병원균이나 바이러스의 오염에 의한 안정성 문제가 최근 크게 대두되고 있어서 재조합 알부민의 대량생산이 절실히 필요하게 되었다. 재조합 단백질 생산시 숙주 세포로서 효모 사카로마이세스 세레비시에가 갖는 단점들의 보완을 위하여 최근에 여러 효모 시스템이 대체숙주로서 개발되었다. 이들 중 효모 한세눌라 폴리모르파는 값 싼 원료물질인 메탄올을 에너지원과 탄소원으로 이용할 수 있어 경제성이 높고, 메탄올 대사에 관련되는 메탄올 옥시다제(MOX) 또는 알코올 옥시다제(AOX) 유전자의 프로모터와 같이 비교적 조절이 용이하면서도 매우 강력한 프로모터를 갖고 있어 산업적 응용 측면에서 응용성이 매우 높다. 또한 고농도 배양이 용이하고 형질 전환시 발현 목표유전자가 숙주의 염색체상으로 다수 도입되어 비선택 배지에서 도입된 발현벡터의 안정성이 뛰어난 장점이 있다. 본 기술은 효모 한세눌라 폴리모르파 DL-1 유래의 MOX 프로모터와 알부민 자체의 분비 시그날을 포함하는 알부민 cDNA를 이용하여 발현벡터를 조립하고, 이를 효모 한세눌라 폴리모르파에 도입하여 조립된 발현벡터가 염색체에 삽입된 형질 전환 효모를 선별, 발효 배양시켜 인간 혈청알부민을 고효율로 발현시켜 인간 혈청알부민을 대량 생산할 수 있는 방법이다