일반기술

대장균의 과발현 재조합 벡터 및 이를 이용한 인 과립구 콜로니 자극인자의 제조방법

대장균 발현계에 적합하게 화학합성된 인간의 과립구 콜로니 자극인자(이하 hG-CSF)의 유전자를 이용한 과발현 벡터 및 그를 이용하여 대장균내에서 hG-CSF를 대량생산하는 방법이다. hG-CSF는 사이토카인류의 하나로서, 조혈계에서 골수의 다기능 조혈간세포(pluriopotent hematopoietic stem cell)로부터 과립구 세포와 거식 세포 등으로의 분화 및 성숙을 유도 조절하는 단백질이다. 본 기술의 hG-CSF 과발현 재조합 벡터는 종래의 기술대로 (1) 특정 DNA서열을 인지하고 그 부위를 절단하는 제한 효소중, 플라스미드상에 있는 특정 부위를 절단할 수 있는 엔도누클레아제를 이용하여 원하는 플라스미드상의 특정 부위를 절단하고, (2) 그 부위에 목적 단백질을 발현하는 유전자를 삽입한 후, (3) 절단 부위를 재결합시키는 리가제라는 효소를 사용하여 절단 부위를 재결합하는 공정으로 제조된다. 이러한 방법으로 재조합된 벡터를 대장균으로 형질전환시키고 이 형질전환체를 순수분리하여 적절한 배지에서 배양함으로써 목적하는 단백질을 대량생산할 수 있다. 즉, hG-CSF 재조합 벡터들은 hG-CSF유전자와 벡터내의 SD부위와 개시코돈 사이의 염기서열 및 전사 터미네이터의 염기 서열을 변형시키고 벡터내의 롭 단백질을 제거함으로써, 종래의 재조합 벡터들에 비하여 숙주세포내에서 월등히 안정하게 과발현되었으며, 아울러 본 기술의 벡터는 적당한 숙주세포와 배양조건에서는 더욱 더 안정하게 발현되었다DNA 재조합기술의 획기적인 발달과 함께 미생물들을 숙주로 사용하여 호르몬류, 사이토카인류, 인터페론류 등과 같은 중요한 생리활성 물질들의 대량 생산이 가능해졌으며 이들 대량 생산된 생리활성 물질들은 유용한 의약품으로 널리 활용되고 있다. 이와 같은 재조합 DNA를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법에서 사용되는 가장 보편적인 숙주세포인 대장균은 유전자 조작이 비교적 용이하고 사용배지의 값이 싸면서도 균체 생성량을 많이 늘릴 수 있다는 장점들을 지니고 있어 매우 유용한 숙주로 알려져 있다. 대장균으로부터 목적 단백질을 대량 생산하기 위해 주로 목적 단백질의 유전자가 클로닝된 플라스미드, 즉 재조합 벡터를 이용하는데, 본 기술에서는 플라스미드를 이용하여 과발현 재조합 벡터를 제작함에 있어서, 첫째, 플라스미드의 자기복제에 관련된 요소(유전자 복사수) 및 안정성, 둘째, mRNA에 관련된 요소(mRNA 합성의 개시율, 합성의 연장과 종료 및 mRNA의 분해율), 셋째, 단백질에 관련된 요소(목적하는 단백질의 번역 개시율), 넷째, 단백질의 분해율 등이 숙주 세포와 적합하도록 고려하여 제작하였다. 본 기술에서는 hG-CSF의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환시킴으로써, 숙주세포내에서 매우 안정되게 hG-CSF를 과발현할 수 있도록 하였다