일반기술

활성형 인간 과립구 콜로니 자극인자의 재생방법

DNA 재조합기술에 의하여 대장균으로부터 생성되는 봉입체(inclusion body) 형태의 인간 과립구 콜로니 자극인자(이하 hG-GSF)를 활성형으로 재생시키는 방법이다. 일반적으로 대장균으로부터 과발현되는 목적 단백질의 대부분이 불용성의 봉입체의 형태로 생산되므로 그 자체의 생리적 기능이 상실된 상태가 된다. 단백질의 활성은 단백질이 자신의 천연구조를 정확히 형성할 때 나타나게 되므로 목적 단백질 고유의 생리적 기능을 회복할 수 있기 위해서는 단백질 덩어리인 봉입체를 적절한 용제로 용해시킨 후 천연구조로 재생시켜야만 한다. 이에 본 기술은 변성된 단백질들이 최적 조건하에서는 봉입체 형태로 진행되려는 경향보다는 자신의 천연구조로 진행되려는 경향을 지니고 있다는 사실에 기초하여, 산화제를 도입하지 않음으로써 인위적인 디설파이드 결합의 형성을 배제하고, 외부환경의 조건, pH, 반응온도, 반응시간, 단백질의 농도 등을 적절히 조절함으로써 봉입체 형태의 hG-GSF가 자연적으로 자신의 천연구조를 형성하여 활성을 회복하도록 하여 상기 단백질의 수율을 높이는 방법을 제공한다. 본 기술은 hG-GSF의 활성화 공정의 일부인 디설파이드 결합의 형성단계에 관한 것이지만, 그 효과는 전체 생산수율에 결정적인 영향을 미칠 정도로 현저하여 hG-GSF의 수율이 월등히 높아지며, 또한 본 기술의 공정은 인위적인 산화, 환원제의 첨가를 배제함으로써 공정을 단축시키고, 비용을 절감하는 효과도 지닌다DNA 재조합기술이 획기적으로 발달되면서 미생물 숙주를 이용한 호르몬, 사이토카인, 인터페론 등과 같은 많은 생리활성 단백질들의 대량 생산이 가능하게 되었고, 이들 중 일부는 이미 유용한 의약품으로 사용되고 있다. 일반적으로 대장균은 유전자 조작이 용이하고 목적 단백질의 생성량이 많으며 배양이 순조롭다는 장점을 지니고 있어 숙주 세포로 주로 사용되고 있으나, 목적 단백질의 대부분이 불용성의 봉입체의 형태로 생산되므로 그 자체의 생리적 기능이 상실된 상태가 된다는 단점도 지니고 있다. 따라서 대장균내에서 생산된 봉입체 형태의 목적 단백질을 목적에 맞게 이용하기 위해 봉입체 형태의 목적 단백질을 활성형으로 재생시키는 단계가 필수적으로 요구된다. hG-GSF는 사이토카인류의 하나로서, 조혈계에서 골수의 다기능 조혈간세포(pluriopotent hematopoietic stem cell)로부터 과립구 세포와 거식세포 등으로의 분화 및 성숙을 유도 조절한다. 대장균으로부터 생산되는 hG-GSF는 N-말단의 메치오닌을 포함하여 175개의 아미노산으로 구성되어 있으며 분자량은 약 19KD정도이고 생체내에 존재하는 천연형과 동일한 생물학적 활성을 나타낸다. 본 기술에서는 봉입체 형태의 hG-GSF를 적당한 카오트로픽제나 계면활성제를 포함한 알칼리성 용액에서 용해시킨 후, 인위적으로 산화제를 가하지 않고서도 자연적으로 천연의 구조를 형성하도록 함으로써 활성형으로 재생시킬 수 있으며, 아울러 활성형 단백질로의 수율 또한 높일 수 있는 방법을 제공한다