일반기술

사람 글루타민 합성효소 유전자를 포함하는 발현벡터 및 이를 이용하여 동물세포에서 에리트로포이에틴을 고수율로 생산하는 방법

사람 글루타민 합성효소(GS; glutamine synthase) 유전자를 이용하여 동물세포에서 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 방법으로, 메티오닌 설폭시민(MSX; methionine sulfoximin)에 의해 증폭되는 GS 유전자를 이용하여 외래유전자를 대량으로 발현할 수 있는 발현벡터를 제조하고, 이를 이용하여 재조합 에리트로포이에틴(EPO)을 동물세포에서 간편하게 증폭시켜 재조합 EPO 단백질을 생산한다. 상술하면 MSX에 의해 증폭되는 사람 GS 유전자를 이용하여 동물세포 발현벡터를 제작하고, 여기에 EPO 유전자를 삽입한 발현벡터 pcDNA-EPO-dE1-gs를 제작한 후, 외래 유전자를 삽입하여 재조합 단백질을 대량 생산하는데 사용될 수 있는 발현 카세트(cassette)를 포함하는 발현벡터 pcDNA-gs를 제작한 다음, 이 발현벡터를 동물세포(CHO)에 형질전환시키고 MSX 농도를 증가시킨 배지에 배양하여 얻은 세포주를 이용함으로써 EPO를 포함한 유용한 재조합 단백질을 고수율로 생산한다. 본 기술에 의하면 단일 단계의 증폭 과정만으로도 다양한 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 세포주를 용이하게 선발할 수 있어, 이로부터 활성이 우수한 재조합 단백질을 효과적으로 생산할 수 있다.EPO는 적혈구 형성자극인자라고도 하는 산성 당단백질 호르몬으로서 EPO를 생산하지 못하는 빈혈증을 치료하는데 사용되고 있으며, 류마티스성 관절염 환자 또는 암 환자에서의 빈혈증 치료, 수술전후의 수혈 대체 등에 이용되고 있다. 지금까지 EPO는 주로 양의 혈장, 사람의 오줌 및 재생불량성 빈혈 환자의 오줌 등에서 추출되었는데, 이를 치료에 사용하기에는 양이 충분하지 않아 널리 이용되지 못하였다. 따라서 EPO를 유전공학적 방법으로 생산하기 위하여 많은 시도들이 이루어지고 있다. 한편 GS는 모든 세포에 발현되는 효소로서 선택 마커로 사용될 수 있고, 이 효소의 억제제인 MSX을 처리하면 높은 복사본 수로 유전자를 증폭시킬 수 있는 특징이 있다. 본 기술의 발현 벡터는 MSX에 의하여 증폭되는 사람 GS 유전자를 이용함으로써, 발현 벡터로 형질전환된 세포에서 외래 유전자를 단일 단계로 간편하고 효과적으로 증폭시킬 수 있고 이로부터 활성이 우수한 형태의 재조합 단백질, 특히 재조합 EPO을 고수율로 생산할 수 있다. 기존의 Cockette 등이 보고한 TIMP 생산성과 비교하여 3배 이상 효율적인 것으로 나타나, 사람 GS 유전자와 enhancer 부위를 제거한 SV40 프로모터를 포함하는 본 기술의 발현벡터는 CHO 세포에서 유전자를 증폭시키는데 매우 유용함을 알 수 있다. 특히, 본 기술은 기존에 많이 사용하여 온 dhfr 유전자를 이용한 경우보다도 더욱 효율적인 것이다