일반기술

UDP－xylose pyrophosphorylase의 유전자 염기서열, 그 발현벡터와 재조합 UXPASE의 생산방법

주반응으로 UDP-xylose를 합성하며, 부반응으로서 TDP-glucose, UDP-glucose, UDP-mannose, UDP-N-acetylglucosamine, UDP-galactose 등 다양한 당핵산염을 합성하는 신규한 UDP-xylose pyrophosphorylase(UXPase)에 관한 것이다. 본 기술의 목적은 신규한 UXPase 효소의 유전자 염기서열을 결정하고, 이 유전자를 포함하는 발현벡터 및 그에 의해 형질전환된 대장균을 배양하여 신규한 내열성 재조합 UXPase 효소를 용이하게 대량생산하는 방법을 제공하는 것이다.본 기술은 고온성 박테리아인 Thermus caldophilus GK24로부터 당핵산염 복합효소를 분리정제하고, 이로부터 제한효소 절단, cosmid library 제조, transformation, southern hybridization 및 subcloning을 통하여 UXPase 유전자를 클로닝한 다음, pGLB와 UXPase를 발현시키기 위한 프라이머 유전자를 사용하여 PCR을 수행한 후, 발현벡터에 삽입하고 대장균에 도입하여 UXPase 발현시켜 정제하고, 정제된 UXPase의 기질특이성과 염 및 온도에 따른 재조합 UXPase의 활성을 측정하는 기술이다당핵산염 합성효소는 삼인산염(NTP)과 hexose 1-P로부터 NDP-hexose를 합성하고 pyrophosphate를 방출하는 가역반응을 촉매한다. 핵산염 합성효소에 의해서 합성된 당핵산염(NDP-hexose)은 효소를 이용하여 연속적으로 glycosyltransferasereaction의 기질로서 사용될 수 있다. 효소를 이용하여 생물학적 활성이 있는 각종 복합 탄수화물 및 탄수화물 유도체를 합성하기 위해서는 전구체인 NDP-hexose를 합성하는 효소가 필요하며, 특히 효소의 정제를 쉽게 하기 위하여 고온에서 안정한 내열성 효소가 필수적이다. 이에 본 기술에서는 주반응으로 UDP-xylose를 합성하고 부반응으로 다양한 당핵산염을 합성할 수 있는 신규한 내열성 UXPase 효소를 제공한다. 본 기술에서의 UXPase의 분자량은 160kDa 이었는데, 아미노산 서열로부터 계산된 분자량(38kDa)과 비교하였을 때 tetramer로서 작용함을 알 수 있다. 또 UXPase의 기질특이성을 조사한 결과 UTP와 xylose 1-phosphate외에 다양한 기질에 기질특이성을 나타냈다.한편, 본 기술의 UXPase는 2가 양이온을 cofactor로서 필요로 한다. UXPase를 Mg2+, Co2+, Ni2+, Mn2+의 존재하에 활성을 측정한 결과, 특히, Mn2+을 사용했을 때에는 Mg2+보다 높은 활성을 나타냈다(Mn2+ ＞ Mg2+ ＞ Ni2+ ＞ Co2+). 또한, UXPase는 80℃에서 1시간동안 100%의 활성을 유지하여 열에 매우 안정함을 알 수 있다. 그러나 90℃ 이상의 온도에서는 불안정하여, 95℃에서 15분의 half-life를 나타냈다. 본 기술에 의하면 상기 신규한 재조합 UXPase를 대량생산할 수 있으므로, 탄수화물 공학에서 기능적 생당체 합성 등 여러 당핵산염을 필요로 하는 생물공학 산업상 매우 유용한 기술인 것이다