일반기술

높은 활성을 갖는 재조합된 C형 간염바이러스 프로테아제

높은 활성을 갖는 새로운 C형 간염바이러스(HCV) 프로테아제 및 이에 대한 저해제 탐색 방법으로, 효모를 이용하여 HCV의 프로테아제의 생체내에서의 활성을 측정하고, 효모의 유전자 발현체계를 이용하여 HCV 프로테아제의 저해제를 탐색하는 방법이다.즉, DNA 결합 부위와 전사 활성 부위 사이에 HCV프로테아제와 그 기질 부위를 첨가시킨 인위적인 전사활성인자로 된 융합 단백질, 즉 HCV의 헬리카제 부위가 제거되고, NS3의 아미노 말단(N말단)과 NS4A가 직접 결합되어 있는 융합 단백질 형태로 합성된 높은 활성의 HCV 프로테아제를 제조하고, 상기 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 효모를 형질전환시킨 후, 배지 위에 론(lawn)으로 키워 여기에 여러 가지 프로테아제 저해제를 적용하는 저해제 탐색 방법이다. 본 기술에 의하면 높은 효율의 C형 간염바이러스의 프로테아제 재조합 및 프로테아제 활성조사 시스템이 제공되며, 효모의 전사 메커니즘을 이용한 C형 간염 바이러스의 프로테아제에 대한 저해제 스크리닝 시스템이 제공될 수 있다HCV는 비A 비B형 간염의 주된 원인으로서, 간염을 일으키고, 간경변을 거쳐 결국 간암을 유발하는 것으로 알려졌다. HCV는 게놈이 약 3,000개의 아미노산을 코드화하는 (+)센스 RNA로 구성되어 있고 지질의 막으로 싸여 있을 것으로 추정되고 있다. 이 HCV RNA의 구조 단백질에 해당하는 코어와 E1, E2/NS1의 프로세싱은, 숙주 세포의 소포체막에 있는 시그널라제가 작용해서 이루어지고, 그 외의 비구조 단백질들의 프로세싱에는 HCV가 코드화하고 있는 NS3이 프로티애즈로 작용하는 것으로 추정된다. 본 기술에서는 효모의 GAL4 단백질의 활성화 부분에 세균의 Lex A 단백질을 융합하여 인위적인 전사 인자를 생산하였고, 이 전사 인자의 DNA-결합 부위와 전자 활성화 부위 사이에 HCV 프로테아제와 이 프로테아제에 의하여 잘리는 부위를 코드하는 염기 배열을 넣고 융합 단백질을 만들었다. 리포터유전자로 β-갈락토시데이즈를 가지고 있는데, 이 유전자 앞에는 Lex A 단백질 결합 부위가 있어 혼성 단백질의 결합과 전사 활성화 기능에 의해 β-갈락토시데이즈 유전자의 발현 정도가 결정된다. 이 혼성 단백질을 코딩하는 플라스미드를 이용하여 효모를 형질전환시킨 후에 β-갈락토시데이즈의 활성 정도를 측정하여 HCV 프로테아제의 활성 또는 HCV 프로테아제 저해제의 활성을 알 수 있다.