일반기술

곤충세포를 이용한 카르복시펩티다제 A의 제조방법

소의 췌장 유래의 프리프로카프복시펩티다제 A (preproCPA) 유전자를 포함한 재조합 발현벡터 및 형질전환된 곤충세포 Sf9 를 이용하여 카르복시펩티다제 A를 제조하는 방법이다. 소의 췌장으로부터 르 휴로우(Le Huerou) 등이 결정한 preproCPA의 뉴클레오티드 서열과는 다른 신규한 preproCPA 유전자를 발견하고, 이를 클로닝하여 그 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 이 신규한 preproCPA 유전자를 함유한 재조합 발현벡터로 형질전환된 곤충세포 Sf9를 제조하여 이로부터 발현된 proCPA에 트립신을 처리하여 활성 CPA를 다량으로 제공하는 방법이다.소의 카르복시펩티다제 A(CPA)는 한 개의 아연 이온을 포함하는 메탈로엑소펩티다제로서, 소수성 말단 잔기 즉, 방향족 혹은 곁사슬의 지방족 그룹을 가지는 폴리펩타이드의 C-말단아미노산을 우선적으로 가수분해하는 효소이다. CPA는 구조와 기능과의 연관성 측면에서 잘 연구된 효소중의 하나로 알려져 있다. 한편, 소의 CPA는 두 가지의 알로형으로 췌장에 거의 같은 비율로 존재하고 있으며, 한 형태는 아미노산 서열 179, 228 및 305번 위치에 이소루이신, 알라닌 및 발린을 가지며, 다른 한 형태는 같은 위치에 발린, 글루탐산 및 루이신을 가지는 것으로 밝혀졌다. 전기 아미노산의 차이로 인하여 크로마토그래피에 의한 분리 양상 및 열에 대한 안정성이 다른 것으로 추측된다. 본 기술에서는 소의 췌장조직으로부터 mRNA를 분리하고 역전사효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응으로 preproCPA 유전자를 증폭하고, 증폭된 DNA 단편을 pBluescript SK(-)의 SmaI 부위로 삽입하여 재조합 플라스미드를 제조하였다. 또, 신규한 preproCPA 유전자의 뉴클레오티드 서열을 EooRI 제한효소로 절단하여 preproCPA 유전자를 분리하고 이를 BamHI 및 EooRI 제한효소로 절단된 배큘로바이러스 전이백터 pVL1393에 삽입하여 재조합 발현벡터 Pvl1393/ppCPA를 제조한 다음, 이 재조합 바이러스로 곤충세포 Sf9을 감염시키고 배양하여 수득한 세포배양액에 발현된 proCPA가 존재함을 웨스턴 블럿 분석으로 확인하였다. 제조된 CPA는 이를 단백질 분해에 사용하거나 또는 효소 반응을 조절하여 특이한 기질로부터의 펩타이드합성에 이용할 수 있다