일반기술

포스포리파아제 C 감마 1 동위효소와 단백질 상호간 결합 효율의 정량적 분석방법

세포내 신호전달체계에 관여하는 포스포리파아제 C 감마 1(PLC-γ1) 동위효소와 결합하는 단백질 상호간의 결합효율을 엘라이자(ELISA)를 통해 정량적으로 분석할 수 있는 방법에 관한 것으로, 신호 전달과정에서 PLC-γ1과 결합하는 단백질 상호간의 결합 효소 및 이러한 결합에 의해 유발되는 세포내 또는 생체내의 비정상적인 현상, 특히 악성 종양의 발생 등에서의 중요성을 확인하기 위하여, PLC-γ1 동위효소의 SH 영역들을 가지고 효모 하이브리드시스템을 이용하여 두 단백질 상호간의 결합효율을 정량적으로 분석할 수 있는 변형된 ELISA 방법을 제공한다. 즉, PLC-γ1 동위효소로 ELISA 반응 플레이트를 코팅한 후, 글루타티온S 전이효소 결합 형태의 단백질을 상기 코팅된 플레이트에 결합시키고, 항 글루타티온 S 전이효소 항체를 반응시키고, 퍼옥시다제가 결합된 2차 항체를 반응시키고, 효소에 대한 기질을 주입하여 반응시키는 단계로 구성된, PLC-γ1 동위효소와 단백질 상호간 결합효율의 정량적 분석방법이다. 본 기술에 의하면 두 단백질 상호간의 결합정도를 단백질이 변성되지 않은 상태에서 정량적으로 분석할 수 있으며, 적절한 항체만 있으면 간단하고 편리할 뿐 아니라 경제적으로 이용할 수 있다. 또한, 이를 토대로 PLC-γ1 동위효소와 관련된 신호전달체계를 차단할 수 있는 물질을 개발, 확인하여 궁극적으로는 PLC-γ가 관련된 암환자에서 화학적 치료제의 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대된다포스포이노시티드에 특이적인 포스포리파아제 C(PLC) 동위효소들은 여러 성장인자들과 세포분열 촉진인자들에 대한 몇몇 초기 세포반응의 하나로서 활성화된다. 그중 PLC-γ는 수용체 티로신 키나아제와 세포내에 있는 티로신 키나아제에 의해 활성화되는데, PLC-γ를 과발현시킨 NIH3T3 세포를 누드 마우스에 이식시켰을 때 종양이 발생하는 것이 관찰되었고, 암조직중 유방암과 결장암에서 PLC-γ가 과발현 되어 있음이 알려졌다. 이러한 PLC-γ1 동위효소와 관련된 신호전달체계 연구와 이 동위효소의 활성을 저해하는 물질의 개발을 위해서는 PLC-γ1 동위효소와 다른 단백질간의 결합 역가를 분석할 필요가 있어서, 본 기술을 개발하게 되었다. 본 기술은 동시면역 침전 반응에서 볼 수 있는 세포내에서의 단백질 상호작용에 대한 정성적인 분석을 넘어서 시험관 내에서의 정량적인 분석이 가능하여, 생체내 또는 세포내 조건에서 하기 어려운 실험들에 대한 대체실험으로도 이용할 수 있다. 즉, 두 단백질간의 상호작용을 촉진 또는 저해시키는 물질을 많은 시료들로부터 탐색하는데 유리하게 이용할 수 있다. 특히 본 기술의 글루타티온 S 전이효소가 결합된 형태의 단백질들을 이용한 분석방법에 있어서는 글루타티온 S 전이효소에 대한 항체를 이용함으로써 원하는 단백질들의 상호작용이 항체에 의해 방해받는 것을 피할 수 있다는 장점도 있다