일반기술

신규 세파로스포린 디아세틸라아제 유전자 및 이를 이용한 단백질 제조방법

세팔로스포린계 항생제 제조에 필수적 전구체인 세팔로스포린C와 7-aminocephalosporanic acid(7-ACA)의 탈아세틸화 반응을 촉진하는 효소와 이의 유전자에 관한 것으로서, 토양으로부터 순수 분리한 신균주가 생산하는 신규한 효소를 세팔로스포린계 항생제 제조 공정에 이용하여, 세팔로스포린계 항생제의 생산성을 향상시키는 새로운 방법을 제공하는데 그 목적이 있다. 본 기술자들은 토양에서 강력한 세팔로스포린C 디아세틸레이즈 활성을 가지는 바실루스종(DS1152)을 분리하였으며, 이 균주로부터 활성효소를 코딩하는 신규 유전자를 분리하였다. 분리된 유전자를 유전자 재조합법에 의해 대장균하에서 여러 가지 벡터시스템으로 대량 증폭하였다. 그 증폭된 효소단백질의 생화학적 특성을 분석한 결과, 기보고된 것과 효소의 생화학적 특성이 상이하게 구분되며, 특히 세팔로스포린C에 대한 기질 친화력과 반응성이 우수하였다세팔로스포린C와 7-ACA 같은 세팔로스포린계 화합물은 아세틸기가 제거됨으로써, 고부가가치 세팔로스포린계 항생제 제조에 반합성 중간체로 이용된다.본 기술에서는 토양에서 신규 세팔로스포린 디아세틸레이즈를 분비하는 신균주를 순수 분리하여, 그 신균주를 동정한 결과 바실루스종으로 확인하고 이 균주를 바실루스 DS1152로 명명하였으며, 이 신균주로부터 디아세틸 세팔로스포린 C, 디아세틸 7-ACA 및 디아세틸 2-메톡시미노-2-푸릴-아세틱 세팔로스포린산 생산에 관여하는, 신규 세팔로스포린 디아세틸레이즈 유전자를 분리하여, 유전자 서열 및 아미노산 배열을 분석하여 신규 효소임을 밝혔다.또, 이 신규 유전자에 의해 코딩된 신규 효소를 분리, 정제하여 생화학적 성질을 조사하였고 분리된 신규 효소의 유전자를 유전자 재조합 기술로 조작하여, 대장균에서 대량으로 증폭, 발현을 하였다. 이 때 발현된 효소는 분자량 24kDa으로, 구조 형태는 이중체로 구성되어 있다.이 신규 재조합효소는 다양한 세팔로스포린계 중간체에 우수한 기질 반응성을 보유하고 있음을 균체 및 효소를 고정화하여 확인하였다. 이러한 신규 기술을 이용하여 세팔로스포린계 반합성 중간체 제조에 응용함으로써, 기존의 합성법보다 산업적으로 매우 유리한 신규 기술을 확립하였다. 본 기술의 효소를 세팔로스포린C와 7-ACA의 탈아세틸화 반응에 이용함으로써, 기존의 다단계 화학합성 공정중 일부 공정의 제거 및 단축이 가능하며, 반응부산물 생성 및 중간체의 분해를 방지함으로서 산업적 생산수율의 향상에 기여할 수 있다