일반기술

유채 티아민 모노포스페이트 피로포스포릴레이즈 유전자 및 이의 분리방법

결핍시 각기병 유발되는 비타민 B1인 티아민을 합성하는데 있어 중요한 효소인 유채 티아민 모노포스페이트 피로포스포릴레이즈(TMP-PPase) 유전자 및 그 분리방법에 관한 것이다본 기술의 목적은 티아민이 보강된 식물체를 개발하기 위해, 기존의 기능성 보상 방법을 변형하여 식물에 속하는 유채로부터 TMP-PPase 유전자를 분리하고, 그 분리방법을 제공하는 것이다. 본 기술은 유채 cDNA 라이브러리 플라스미드를 도입한 TMP-PPase 결손 대장균을 티아민이 결여된 액체 선택배지에서 배양한 후, 이 배양액을 동일한 액체 선택배지에 희석하여 배양하고, 다시 이 배양액을 아가로스 평판 선택배지위에 도말한 후 배양하여 콜로니를 얻고, 이 콜로니로부터 플라스미드를 얻은 다음 제한 효소로 절단하여 TMP-PPase cDNA 유전자를 분리하는 방법이다. 본 기술에 의하면, 상기 유채 TMP-PPase cDNA 유전자는 식물에서 최초로 확인된 것으로, 티아민이 보강된 식물체의 개발에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 기술의 유전자 분리방법은 기존의 기능성 보상방법에서의 배양을 희석배양으로 변형함으로써 티아민과 같이 미량으로 기능하는 물질의 합성에 관련된 효소 유전자의 분리에 매우 유용하게 사용될 수 있다.티아민(비타민 B1)은 필수 영양소로, 세포 대사에 관여하는 다수 효소에서 조효소로 작용한다. 티아민은 보통 음식물을 통해 섭취되는데, 티아민이 보강된 식물체가 개발된다면 각기병의 예방 및 치료를 통해 인류의 건강증진에 기여할 것으로 기대되고 있다. 그러나 식물체내의 티아민은 극히 미량이어서, 연구의 어려움이 매우 크고 실제로 식물에서 티아민의 합성 및 조절 기작에 대하여도 거의 알려지지 않고 있으며 더 나아가 티아민 합성에 경로중에 가장 중요한 역할을 하는 효소인 TMP-PPase의 유전자에 대하여는 전혀 보고된 바가 없는 실정이다. 본 기술에 사용한 유전자 분리방법은 종래 잘 알려진 기능성 보상(functional complementation) 방법을 변형한 것으로, 종래의 방법에서는 기능성 유전자가 도입된 미생물로부터 회복된 기능에 관련된 물질의 일부가 세포외로 방출된 후 기능이 상실된 다른 미생물에 의해 다시 흡수되는 단점이 있어, 미량으로도 기능을 발휘하는 티아민 등의 합성에 관여하는 기능성 유전자에 이 방법이 직접 적용될 경우, 기능성 유전자가 도입된 미생물의 선별이 불가능해진다. 본 기술에서는 TMP-PPase cDNA 유전자가 도입된 대장균에서 이 유전자 산물에 의해 대장균 자신의 상실된 TMP-PPase 활성이 보상됨으로써 티아민이 합성되어 티아민이 없는 선택배지에서 생존할 수 있으며, 배양액을 다시 희석 배양함으로써 이 대장균으로부터 합성된 티아민의 일부가 세포밖으로 방출되더라도 인접한 대장균에 흡수되어 이용되는 문제점이 없다