일반기술

고생산 세포융합변이균주에 의한 사이클로스포린 A의 제조방법

면역 억제물질인 사이크로스포린 A(Cyclosporin A)를 생산하는 균주인 톨리포크라디움 인풀라툼(Toypociadiuminflatum) 야생균주를 토양에서 분리하여 이 균주에 자외선을 돌이변이원으로 아미노산 요구성 균주를 개발하고 다른 2개의 영향 요구주를 세포융합시켜 아미노산 및 유기태 질소원의 이용성이 증가하면서 사이클로스포린 A를 많이 생산하는 고생산 세포융합변이균주 KD461을 만들고, 이들 세포융합변이균주에 적합한 배양조건 및 배양 방법을 확립하여 액침 발효법에 의한 사이클로스포린 A 생산방법에 관한 것이다.사이클로스포린 A는 11개의 아미노산으로 구성된 환형 펩타이드로서 5, 11 위치에 발린 및 4, 6, 9, 10위치에 루이신의 아미노산 및 그 유도체가 각각 위치한다. 사이클로스포린 A 생산균주인 톨리포클라디움 인풀라툼 NRRL 8044는 아미노산들중에서 L-발린과 L-루이신을 배지에 첨가하면 사이클로스포린 A를 선택적으로 생성함이 알려져 있다. 본 기술에서는 사이클로스포린 A 생성을 증폭시키는 방법으로 토양에서 체취한 사이클로스포린 A를 소량 생산하는 톨리포클라디움 인풀라툼 야생균주를 돌연변이시켜서, 목적산물의 구성물질로서 전구체의 가능성이 있는 아미노산인 L-발린과 L-루이신의 영양 요구주를 각각 만들어 그들의 영양 요구성을 증폭시킨 후, 두가지의 영양 요구주를 세포융합시켜 L-발린과 L-루이신의 요구성이 동시에 증가되어 목적산물인 사이클로스포린 A의 생성능력이 증폭된 세포융합변이균주 KD461을 만들었다.융합주 KD461은 맥아-효모 추출물의 고체 배지상에서 친균주에 비해 균증식이 다소 느리고 콜로니의 색깔이 연회색으로 더 짙고 콜로니 뒷면은 짙은 갈색을 띄는 특성을 갖고 있다. 또한 액체 배양에서는 균사가 다소 짧고 두꺼우며 분절 포자의 형성이 많다.아미노산으로 첨가해주는 L- 발린과 L-루이신 및 유기태 질소원의 요구량이 증대되어 사이클로스포린 A의 생성량이 크게증가되는 특징을 보여 친균주에 비해 약 50배의 사이클로스포린 A 생성능을 갖고 있어서 친균주와는 다른 새로운 변이주임을 보여준다.