일반기술

사람 인슐린 전구체의 제조방법

당뇨병치료제인 사람 인슐린의 전구체 제조방법에 관한 것이다. 본 기술은 인슐린전구체(프로인슐린) 융합단백질을 함유하는 봉입체를 변성제를 포함한 완충용액에 용해시키는 동시에, 설포네이션시켜 프로인슐린 S-설포네이트의 용합단백질을 수득하는 공정,시아노겐 브로마이드(CNBr)를 처리하는 공정, 2-메르캅토에탄올이 첨가된 완충용액과 혼합한 다음 교반하여 프로인슐린을 포함하는 재접힘(refolding) 반응혼합물을 수득하는 공정 , 극성 메타크릴레이트계 수지에 흡착시켜 활성형 프로인슐린을 수득하는 공정 및 트립신 등의 효소를 처리하여 활성형 인슐린을 제조하는 공정으로 이루어짐을 특징으로 한다. 종래의 제조방법은 프로인슐린 융합단백질을 함유하는 봉입체를 용해시킨 후 설포네이션 전처리 없이 바로 시아노겐 브로마이드를 처리 하고 이어 설포네이션공정, 프로인슐린을 포함하는 재접힘 반응혼합물을 수득하는 공정으로 이루어 진다. 이러한 종래의 방법은 프로인슐린 융합단백질의 용해시 고농도의 시료가 분자간의 중합화(polymerization)로 인해 정제시 겔화 현상과 같은 변성이 발생하며, 용해시 분자간의 잘못된 디설파이드 결합으로 인한 시료의 용해도 감소등의 문제점을 안고 있다. 또한 용해와 설포네이션의 과정과 정제, 농축 및 탈염의 과정이 복잡하고, 재접힘 반응의 효율이 떨어져 산업적 생산에 있어서 프로인슐린의 수율 향상을 기대할 수 없었다. 본 기술은 용해와 설포네이션을 동시에 수행하므로써 후속공정을 단순화 시키고 재접힘 반응의 수율향상 및 규모증가시의 재현성을 확보하여, 고수율로 프로인슐린 수득이 가능하다. 본 기술에 따른 인슐린은 제품은 국내임상이 2001년에 종료되어 시판 될 예정이다인슐린 전구체는 A쇄, B쇄 및 이를 연결하는 X쇄(또는C쇄)로 구성되어 있으며, 6개의 시스테인 잔기로부터 형성된 3개의 디설파이드 결합이 존재한다. 본 기술은 대장균 발효에 따라 생성된 프로인슐린 융합단백질을 요소용액 또는 염산 구아니딘 용액으로 용해시키는 과정 중에 소디움 테트라티오네이트(Na2S4O6)와 소디움 설파이트(Na2SO3)를 동시에 처리함으로써, 인슐린 전구체의 시스테인 잔기의 -SH 기를 S-SO3-로 치환하여 프로인슐린 S-설포네이트를 제조함으로써 인슐린 전구체의 안정성을 증가시키고, 후속공정인 재접힘 반응의 효율성을 증가시킴을 특징으로 한다. 제조된 활성형 프로인슐린은 트립신(trypsin)과 카르복시펩티데이즈B (carboxypeptidase B)를 사용해서 X쇄(또는 C쇄)를 제거함으로써 활성형 인슐린으로 전환된다. 본 기술에 따른 사람 인슐린 전구체의 제조방법의 장점은 다음과 같다. 첫째, 용해와 설포네이션을 동시에 수행함으로써 생산공정을 단순화 할 수 있다. 둘째, 용해시 고농도의 시료가 분자간의 중합화로 인해 생기는 정제 과정상의 겔화 현상과 같은 변성을 막을 수 있다. 셋째, 용해시 분자간의 잘못된 디설파이드 결합으로 인한 시료의 용해도의 감소를 근본적으로 해결할 수 있다. 넷째, 시아노겐 브로마이드 반응 전단계에서 시스테인기의 -SH 기를 -S-SO3-로 치환함으로써, 용해와 이후 공정에서 발생할 수 있는 시스테인기의 비가역적(irreversibile) 변성, 예를 들면, 시스테인이 시스테인산으로 변성되는 등의 현상을 막을 수 있어 수율 향상을 기할 수 있다. 다섯째, 시아노겐 브로마이드 반응 후 감압건조 한 다음 탈염 등의 어떠한 전처리없이 이온교환 크로마토그래피 또는 흡착 크로마토그래피를 수행함으로써 공정의 연속성을 부여하는 장점을 가진다. 인슐린은 2000년 현재 국내시장은 200억원이며 해외시장은 22억불에 이른다. 대부분이 수입에 의존하고 있는 실정이므로 발매시 수입대체효과 및 해외시장성이 매우 높다