일반기술

제조합 프로인슐린의 제조방법

중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지에 금속이온을 결합시켜 제조한 금속 친화성 수지를 사용하여, 재조합 대장균으로 부터 발현된 비활성형 프로인슐린의 활성형으로의 전환과정 중에 형성되는 프로인슐린 S-설포네이트를 선택적으로 분리하는 방법이다. 프로인슐린 S-설포네이트의 정제에 본 발명의 방법을 이용하면, 경제적으로 고순도의 프로인슐린 S-설포네이트를 제조할 수 있다. 비교적 강한 압력하에서도 파괴되지 않으면서 적정가격으로 용이하게 입수할 수 있는 Diaion CR11 수지에 금속이온을 결합시켜 제조한 금속 친화성 수지를 사용하여, 재조합 대장균으로 부터 발현된 비활성형 프로인슐린의 활성형으로의 전환과정 중에 형성되는 프로인슐린S-설포네이트를 선택적으로 분리하고, 이로부터 프로인슐린을 제조한다. 즉, 폴리히스티딘 표지를 함유하는 융합펩타이드가 프로인슐린의 N-말단에 연결되어 발현된 직쇄 프로인슐린 전구체에 시아노겐 브로마이드를 처리하여 전기 융합펩타이드를 프로인슐린으로부터 유리시키고, 전기프로인슐린의 시스테이닐 잔기를 아황산화시켜 프로인슐린 S-설포네이트 함유 단백질 혼합물로 제조한 후 전기 단백질 혼합물의 pH를 8.5 내지 9.5로 조정하고, 이미다졸을 포함하는 전기 pH의 인산완충용액 또는 붕산완충용액으로 평형이 유지된 금속이온이 결합된 중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지에 가하고, 3시간 이상 뱃치법 또는 칼럼법으로 반응시켜, 유리된 폴리히스티딘 표지 및 폴리히스티딘 표지가 유리되지 않은 프로인슐린 전구체를 전기 수지에 결합시키고 반응상층액 또는 칼럼 통과액으로부터 프로인슐린 S-설포네이트를 수득한다.고정화 금속 친화성 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography)는 재조합 단백질의 정제를 위하여 개발되어, 재조합 인간 인슐린 생산을 위하여 응용되기도 하였다. 예를 들면, 목적 단백질인 프로인슐린과 상응하는 서열을 가진 폴리펩타이드의 N-말단에 금속이온 친화성 표지(tag)를 포함하는 융합단백질을 발현시킨 다음, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 수행함으로써, 친화성 표지와 고정상의 금속이온간의 결합력에 의해 단백질을 분리하는 방법이 있다. 그러나, 금속 친화성 수지는 구입비용에 대한 부담이 지대할 뿐만 아니라, 정제시의 일반적인 압력에서도 쉽게 파괴되므로, 산업적 규모의 인슐린 생산공정에 사용하는는 부적절하였다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 친화성 표지를 지닌 목적 단백질을 함유하는 혼합단백질의 수용액에 금속이온을 직접 첨가하는 뱃치법을 이용하여 프로인슐린을 정제하였다. 그러나, 이러한 정제방법 역시단백질의 비특이적 응집이 일어나, 목적 단백질의 정제가 용이하지 못하다는 문제점을 노출시켰다. 본 기술에서는 금속이온이 결합된 중합성 대형 망상조직의 킬레이트 수지를 사용하는 금속 친화성 크로마토그래피를 통하여 재조합 대장균으로부터 발현된 프로인슐린을 제조하므로써 고순도 고수율의 분리정제가 가능하다.