일반기술

단백직의 재조합 생성

천연 단백질을 암호화하고 있는 이형 DNA의 생물학적 발현. 재조합 단백질의 분리와 특성화. 재조합 단백질과 천연 단백질의 대등성 인증.제 1단계로서 상호 보완적인 DNA를 얻기 위하여 특정 단백질을 암호화하고 있는 전달자 RNA (mRNA)를 분리함. 그 후 중합 효소 연쇄 반응 ( PCR )을사용하여 cDNA를 증폭시킨 후 복제 벡터의 폴리뉴클레오티드 서열 내에 삽입하여 염기 서열을 획득하고 두 번째로 여러 개의 숙주 세포에서 재조합 단백질 분자의 생성 운반체로 작용하는 발현 벡터 내에 다시 복제된다. 최근 두 종류의 이형 숙주계가 이러한 목적으로 사용되고 있다.세균계의 예로 Escherichia coli가 사용되고 있으며 진핵 세포 모형으로 pichia pastoris가 사용되고 있다. 강한 프로모터를 사용하여 재조합 단백질의 합성을 증가시키는 방법이 자주 사용됨. 재조합 플라스미드가 숙주 세포를 완전히 전환시킨 후 최적의 성장 조건하에 세포를 배양하다가 생성을 중지시킨다! 따라서 재조합 단백질의 양을 판단하는 것이 용이하며 또한 생성률은 높고 분해율은 낮은 상태에서 균형을 이룬다.Sodium dodecylsulfate ( SDS- PAGE )가 존재하는 상태에서 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시하는 것이 재조합 단백질이 합성되는 도중에 세포 배양액 내에 존재하는 이온 양을 측정하는 가장 유용한 방법이다. 최근 사용되는 프로토콜에서는 자주 공유 결합을 통하여 연결된 폴리펩타이드 사슬을 생성한다. : 특정 단백질-합성의 목적 -이에 더해 발현 벡터에 첨가된 cDNA가 지시하는 다른 단백질 혹은 펄리펩타이드 조각 이상의 방법을 사용하였을 경우 소위 융합 단백질로 불리는 물질을 얻게 되며 재조합 단백질의 합성 유도와 나아가 불리의 양을 증가시킬 목적으로 사용된다. 발현 세포 배양을 통하여 획득된 재조합 단백질은 정화 과정을 거쳐 동질성을 가지게 된다. 이러한 분리를 위하여 단백질의 생리 화학적, 구조적 심지어 기능적인 특성까지 분리 기준으로 사용 가능하다. 용해도, 분자량, 전하, 소수성 혹은 리간드 결합 능력 등의 특성을 사용하는 것이 가능하다.재조합 배지는 항상 고농도의 발현 산물을 포함하기 때문에 이러한 프로토콜은 해당하는 자연 원료를 사용하였을 경우에 비해 재조합 단백질을 정화시키는 것이 보다 쉽고 나은 결과를 가져온다. 자연 단백질과 재조합 단백질 사이의 대등성을 측정하기 위하여 재조합 단백질의 특성을 파악하는 것이 반드시 필요하다. 따라서 재조합 기술을 통하여 합성된 단백질의 구조와 기능적 특성에 대한 연구가 이루어져야 하며 자연 원료에서 얻은 해당 산물과 비교되어야 한다. 특정 단클론성 또는 다클론성 항체에 대한 반응을 측정하는 등의 보완 분석은 재조합 단백질의 안정성을 측정하는 유용한 방법이다. 그러나 분자적 지표와 생화학적 활성은 재조합 단백질의 사용 목적에 따라 최소한의 요구 조건에 부합해야 한다.혁신적인 사항:재조합 DNA 분자의 발현은 자연 상태에서는 드물거나 분리가 어려운, 매우 잘 정의되어 있고 동질성이 높은 단백질의 무제한적 합성에 적합한 방법이다. 이뿐만 아니라 유도된 유전자의 돌연변이를 통하여 자연 단백질의 변형된 유도체를 합성할 수 있으며 안정성 혹은 생물학적 활성과 같은 특성을 변형하여 사용 목적에 부합하는 산물을 억을 수 있다. 주요 장점:이형계에서 재조합 DNA를 사용하여 단백질과 펩타이드를 합성하는 것은 다양한 임상 적용과 생명 공학적 사용이 가능한 확연한 과학적 발전이다. 많은 양의 정화된 동질성 분자를 얻는 것이 가능해 짐으로서 많은 양이 소모되는 분자적, 면역학적 그리고 기능적 특성을 파악하는 과정이 보다 용이해졌으며 나아가 병리학적 현상의 치료와 진단에 대한 임상적 적용도 향상될 수 있다. 특히 알러지 분야에서 이 기술을 적용함으로써 유일한 재조합 알러지 항원을 다루고 다른 농도와 성분을 가진 특정 혼합물을 조합하여 특정 필요에 따라 사용하는 것이 가능하다.