흰불나방유래의 EC-SOD 단백질 및 이를 코드하는 유전자
흰불나방이 생산하는 SOD단백질 및 유전자의 분리 및 특성분석에 관한 연구.
- 보유기관
- 한국생명공학연구원
- 등록일
- 2000-04-07
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흰불나방이 생산하는 SOD단백질 및 유전자의 분리 및 특성분석에 관한 연구.
단백질은 많은 단계의 과정을 통해서 농축되고 정제된다. 크로마토그래피법이 단백질 정제의 최종단계에 있어서 가장 중요한 역할을 하고 있지만, 침강법, 초여과법, 투석법, polyelectrolytes를 이용한 위상차 분리법들 또한 중요하게 사용된다. 생체물질의 농축과 정제에 사용되어 지는 대부분의 하이드로젤(분산 용매에서 물을 사용한 젤)은 전기적으로 중성일수도, 음성일 수도, 양성일 수도 있다. 그러나, 합성된 다양성전해질(polyampholyte)들은 하이드로젤과 성질이 유사함에도 불구하고 이제까지 단백질의 농축과 정제, 그리고 분리에 사용되지 않았다. 이 다양성전해질을 사용하기 위해서 두가지의 접근방법이 개발될 것이다.첫 번째 방법은 다양성전해질을 이용한 선택적 위상 분리법을 통하여 단백질을 정제하는 것이다. 다양성전해질이 자신의 등전위점에서 스스로 침강하는 성질을 이용하여 단백질의 추출과 정제에 사용하는 것이다.두 번째 방법은 다양성전해질 표본내에 pH-gradient(pH-경사도)를 만들어내어 단백질을 분리하는 것이다.단백질 정제와 분리에 이용되는 새로운 방법의 개발(통상적인 방법보다 더 단순하고 효과적인 방법)
DNA를 재조합하는 기술의 발전에 힘입어, 많은 진핵생물 단백질들의 과학적인 연구와 실제적 응용이 가능해졌다. 대장균과 같은 세균세포의 단백질 초합성 과정에는 종종 비용해성의 봉입소체(inclusion body)가 형성된다. 재조합 단백질 분자의 folding과정에서, 분자간 상호작용으로 인해서 몇몇 중간산물이 안정화되는 현상이 나타난다. 그 결과 봉입소체가 변성되고 응집된 형태로 나타나게 된다. 이 봉입소체를 용해시키는데는, guanidinium salts, 요소, sodium dodecyl sulfate, 희석된 염기등의 강력한 시약이 필요하다. 이러한 시약들의 작용으로 인해 용해된 단백질들은, 종종 원래의 물질로 재복귀하는 현상이 나타나게 된다. 그러나, 몇몇 경우에 있어서는 단백질이 재복귀하지 않게 된다. 그 경우는 방사성 진동 전기장을 사용한 경우이다. 방사성 진동 전기장을 사용하면, 분자간 상호작용에 영향을 미쳐서 단백질의 응집현상을 줄일 수 있다.재조합 단백질을 포함한 생물학적 활성 물질의 생명공학적 연구
이번 우리의 연구는 분자생물학적인 이론과 단백질 일차구조의 진화이론에 그 기초를 두고 있다. 또한 인공 개념 지능(Artificial Conceptual Intelligence)을 이용하고 있다. 연구의 대상이 되는 고분자 물질은 인슐린과 헤모글로빈, 그리고 사이토크롬이다. 또한 폴리펩티드와 일반화된 폴리펩티드, 일반화된 아미노산, 일반화된 트리플렛의 개념이 이용되었다. 이러한 연구의 결과로 다음과 같은 일들이 가능해질 것이다. 1)진화과정에서의 m-RNA일차구조 변동의 재생 2)단백질 일차구조 변화를 규정하는 점 돌연변이의 분류 3)상동관계를 갖는 단백질 들의 보충, 즉, 새로운 단백질의 생산상동관계를 갖는 폴리펩타이드와 핵산의 분석을 위한 전산 시스템의 개발, 점 돌연변이를 분류하는 방법의 개발(전산화된 형식으로), 생체 고분자 물질의 특성에 관한 지식을 통하여 바이오컴퓨터를 생산하는 방법의 개발
이 연구의 주요한 목표는 단백질 Kinase C 의 잠재적인 억제제로서 한 두 개의 indole-N-glycosidic residues 와 그것의 치환된 유사물질을 가진 indio[2,3-a]carbazole glycosides 의 입체선택적인 합성법의 개발이다. 효과적이고도 일반적인 합성법은 천연 생물학적 활성 화합물과, 생물학 및 의약에 그들의 잠재적으로 관심 있는 동족의 제조를 촉진시킬 것이다. 단백질 Kinase C는 세포막을 가로 질러 다양한 중재자로부터 신호 변환에 중요한 역할을 한다.(Farago A., Nishizuka Y., FEBS Lett., 268, 350 (1990)). 많은 홀몬, 식물 성장 홀몬, 신경전달체 및 성장계수에 의한 수용기관 점령의 결과는 단백질 Kinase C의 활성으로 되며 이것은 차례로 세포의 활성, 분비 및 증식으로 연결된다. 이처럼 단백질 Kinase C는 와 암, AIDS, 건선, 류마티스성 관절염, 천식 및 고혈압과 같은 질병의 발병원인에 관련되어 있는 것 같다.새로 합성된 글리코사이드는 세포 증식, 분비 및 유전자 표현에 관한 조절기구의 연구에 있어서 계기로서 작용할 것이다. 또한 신호변환 수준에서 작용하는 신세대 잠재 약물로 검토될 것이다.
단백질 분리 및 정화는 점점 더 중요해지고 있다. 그리고 이들 공정의 비용과 효율은 생물공학 단백질의 상업화와 관련 산업의 생산성에 많은 영향을 끼친다. 단백질은 보통 일련의 많은 단계를 거쳐 농축되고 정화된다. 크로마토그라피(색층분석)가 최종 정화단계에 핵심 역할을 한다 하더라도, 침전, 한외여과, 투석 및 다중전해질에 의한 상 분리도 역시 중요하다. 우리들은 polyampholyte gel의 도움으로 다른 분자량과 등전기점을 가진 단백질 혼합물의 선택적 분류를 제안한다. 일차 방법에 따르면 미리 건조된 암포라이트 하이드로겔 알맹이는 수용액에서 단백질 혼합물을 흡수하며 이차에서 단백질의 정화가 직류 전기장의 작용 하에서 일어난다.효소 부동화를 위한 polyampholyte hydrogel 의 적용
우유에 함유된 단백질인 카제인을 단백질 분해효소로 분해하므로써 카제인데카펩티드를 얻을 수 있다. 이 펩티드는, 혈압을 상승시키는 원인물질인 안지오텐신 전환효소에 대하여 저해작용이 있기 때문에, 혈압강하제로써 효과적이다. 이 카제인을 함유하는 식품(5~50%포함)을 일상적으로 섭취하므로써, 식생활을 통하여 혈압의 조절을 도모할 수 있으며, 건강증진과 유지를 도모할 수 있다. 예방적인 혈압조절에 효과가 있기 때문에, 혈압이 높은 사람의 건강유지와 증진에 효과적이다. 안전성에도 문제가 없다는 것을 확인했다.
This invention is about a novel compound which suppresses type IV collagenase separated and purified from Weterdykella multispora strain cultivation solution saved from soil, its manufacturing method, and a component which contains it and suppresses type IV collagenase activity.
. 담배(Nicotiana tabacum)에 도입된 인체 인터루킨-2, 인터루킨-6, 인슐린 유전자들의 transgenic 담배 제4세대로의 안정적 유전 및 발현 확인. 담배에 도입된 해녀콩 레그헤모글로빈 유전자의 transgenic 담재 제 2세대로의 안정적 유전 및 발현 확인. 2. Transgenic 담배에서 인체 인터루킨류와 인슐린 유전자의 강력한 발현을 이끌 수 있을 것으로 판단되는 담배모자익바이러스(TMV)를 기초로한 expression vector의 조립 착수. Transgenic 담배에서 생성되는 인터루킨 또는 인슐린 단백질의 세포밖으로의 분비를 위한 signal peptide를 기록하는 DNA 합성. 3. 브로꼴리와 양배추와 배추의 웅성불임화를 가져올 것으로 판단되는 cDNA 클론들(BASC-1과 BASC-2)의 완전한 염기서열 결정. 4. BASC-1과 BASC-2 유전자의 브로꼴리 화아 발달과정에서 정확한 발현 위치를 확인하기 위한 in situ 분석. 5. 브로꼴리와 양배추와 배추의 웅성불임화를 위한 expression vector의 조립에 필요한 promoter의 확보를 위하여 BASC-1과 BASC-2의 genomic 클로닝. 6. 이미 조립된 BASC-1 또는 BASC-2 유전자가 cauliflower mosaic virus의 35S promoter뒤에 antisense 방향으로 삽입된 웅성불임 유도용 재조합 DNA를 배추에 도입하여 발현.
Peptide library중의 한종류인 soluble 형태이면서 수억종류의 무작위 peptide 서열 혼합물을 함유한 PS-SPCL 합성법을 확립하였으며, 면역활성화제 개발을 위한 탐색용 면역세포주 선정 및 탐색조건을 확립하였다. 확립된 탐색법으로 PS-SPCL을 이용하여 1차 검정 결과, 각 position에서 활성화효과가 높은 아미노산을 선정하였으며, 여러차례 반복 검정한 결과, 면역세포 활성화 효과가 높은 PEP-1, PEP-2, PEP-3 및 PEP-4를 개발하였다. 이들 peptide (hexamer)들은 nanompl order에서 아주 강한 효과를 나타내었으며, B lymphocyte중의 하나인 human B myeloma (U266) 세포에서 뿐만 아니라 다른 유래의 세포인 U937 및 HL60 세포에서도 강한 효과를 나타내었다. 한편, 면역억제제 개발을 위하여 cyclophilin과 FKBP를 이용하여 신속하고도 예민하게 측정할수 있는 탐색체계를 확립하였다. 즉, immnophilin이 peptidtyl-propyl-cis-trans- isomerase의 활성을 독립적으로 지니고 있다가 그 활성이 면역억제제인 cyclosporin A나 FK506과의 결합에 의해 저해되는 것을 응용하였으며, 확립된 탐색법으로 PS-SPCL로 면역억제제 개발을 위한 초기 검색한 결과, 각 position에서 면역억제 효과가 있는 중요한 아미노산을 결정하였다.
본 개발기술을 통해 생산된 면역단백질을 이용하여 초유를 완전히 공급받지 못한 유아 혹은 어린가축에 조제분유 혹은 이유식에 첨가할 수 있으며, 기타 면역기능의 보강 및 질병예방효과가 있는기능성식품의 소재 혹은 그 용도로 활용가능.한외여과기를 이용한 면역단백질의 수율증가 방안확립. - 음이온 교환수지처리를 통한 면역단백질의 순도증가방안 확립. - 면역단백질의 산업적 생산방안 가능성 확인. - 면역단백질의 이용한 육제품 등 면역기능성 식품개발.- 본 연구에서 개발된 면역단백질의 생산기술은 특정성분 강화 기능성 식품으로서의 활용이 기대되며 정제를 통한 순도의 증가로 식품에서 뿐 아니라 의약품 및 특수용도로서의 사용가능성 개발도 기대됨. - 특히, 환경문제의 심각성이 강조되는 추세에서 폐기되는 혈액의 처리를 통하여 공해 원인물질의 감소 및 부가가치 향상에 기여
유성 세포 측정방법을 이용하여 세균 내에 발현된 단백질을 형광 항체를 이용하여 탐색함으로써 세균 세포 내에서 발현된 특정 단백질의 양을 측정하는 방법에 관한 것으로, 이를 이용하면 세포내 단백질이 발현되는 적합한 조건 등을 분석할 수 있다.세균내의 단백질을 측정하는 방법은 우선 세균을 세포벽을 제거하는 효소인 0.1-5mg/ml의 리소자임으로 처리하여 원형질막으로만 이루어진 구형질체를 얻고, 그 구형질체를 1-8%의 파라포름알데히드를 사용하여 고정한 다음, 고정된 세포를 0.05-0.5%의 사포닌으로 처리하여 구형질체의 원형질막을 부분적으로 녹여내고 고분자량의 측정시약이 원형질막을 통과하게 처리하여 유성 세포 측정방법을 이용하는 것이다.
살모넬라 균주의 L-아라비노즈(arabinose) 오페론을 이용한 유도성 프로모터하에서 발현되는 융합파트너 PRK(phosphoribulokinase) 및 목적 단백질인 인간 부갑상선 호르몬(human parathyroid hormone: hPTH)의 융합유전자가 포함된 발현벡터로 형질 전환된 재조합 대장균을 초기 배양배지에 접종하여 회분식으로 배양하다가, 용존산소의 양이 급격히 증가할 때부터 유가배지에서 배양하면서 동시에 L-아라비노즈를 첨가하여 단백질의 발현을 유도하는 공정을 포함하는, PRK를 융합파트너로 하는 재조합 hPTH의 대량생산을 위한 DO-stat 유가식 배양방법에 관한 것이다.DO-stat 유가법이란 용존산소량을 발효조내 영양 성분의 고갈 정도의 지표로 삼아 용존산소량이 일정 수준 이상 증가하면 영양 성분을 유가법으로 보충하여 주고, 이후 보충된 영양 성분의 소비와 함께 감소된 용존산소량이 영양 성분의 고갈로 인해 다시 증가하면 영양 성분을 또 다시 보충하여 주는 유가법을 의미한다. 배양액 중 용존 산소량을 측정하여 용존산소가 50% 포화 이상일 때 배지를 주입하고, 50% 이하로 떨어질 때 배지 주입을 중단하는 DO-stat 유가법을 자동으로 조절하여 배양이 끝날 때까지 반복한다. 이러한 DO-stat 유가식 발효방법에 의하면, 세포 성장, 플라즈미드 안정성및 PRK를 융합파트너로 하는 재조합 hPTH의 발현량 모두를 높은 수준으로 안정적으로 유지시키므로, 저렴한 비용으로 재조합 hPTH를 대량 생산하게 된다
포스포리페이즈 D1(PLD1)활성을 저해하는 테트라펩티드 및 이의 선별방법에 관한 것으로 세포내 신호전달 과정은 외부 자극을 수용하여 여러 세포에서 다양한 세포기능을 유발한다.포스포리페이즈 D1 저해 활성을 갖는 새로운 테트라펩티드를 제공하며 합성 테트라펩티드 라이브러리로부터 테트라펩티드를 선별한다PLD1을 특이적으로 저해함으로써 PLD1에 의해 유도되는 세포분열, 세포내 분비 과립의 이동 및 분비, 분화, 세포골격의 변화 등을 효율적으로 조절할 수 있다
사람 단핵구(monocyte)에서 수퍼옥사이드(superoxide)의 발생을 촉진시키는 헥사펩티드(hexameric peptide)에 관한 것으로 단핵구는 생체 면역 시스템의 초기 단계에서 중요한 역할을 한다. 외부에서 박테리아와 같은 미생물이 조직에 침입했을 때 생체 면역 시스템은 대식세포(macrophage), 중성구(neutroghil)와 같은 거식세포들이 직접 박테리아를 거식작용(phagocytosis)을 통해 세포 안으로 받아들여 파고좀(phagosome)에서 여러가지 분해효소를 통해 초기단계에서 제거한다. 또한 단핵구는 미생물의 침입에 대응하여 조직에서 여러 가지 염증반응 결과 생성되는 물질을 거식작용을 통해 제거하는 중요한 역할을 한다. 이때 파고즘과 세포막을 통해 막단백질인 NADPH옥시데이즈에 의해 수퍼옥사이드가 생성되어 박테리아를 죽이는 등의 역할을 수행하게 된다아미노산 서열을 갖는 헥사펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된, 수퍼옥사이드의 생성을 촉진하는 헥사펩티드를 제공하며 수퍼옥사이드 생성을 촉진함으로써, 새로운 면역증강제로서 또는 면역세포의 활성화에 수반되는 신호전달 과정을 밝히는데 도구로 사용될 수 있다.
"나르시스는 게껍질에서 얻어진 천연물질 키토산에 근거하여 개발되었고, 종자 및 토양으로 전염되는 질병으로부터 식물을 보호하기 위해 고안되었다. 이 제제는 발아, 종자의 발아 에너지 및 식물 성장률을 촉진하고, 특히 뿌리내리는 과정이나 관목화되는 과정에 유용하게 작용하며 농작물(곡류, 해바라기, 사탕수수, 야채 등)의 수확을 적어도 20∼25% 상승시킨다. 나르시스는 식물조직 대사에 대한 명확한 효과를 나타내어 식물 자체의 방어력을 활성화 시키는 키토산의 특수 활성에 의해 높은 효능을 가지게 된다. 식물병원성 곰팡이에 대한 높은 활성을 가져 차별화되는데, fusariose (fusarium속 식물 곰팡이균에 의해 감염되는 질병)에 의한 감염율을 90∼95% 감소, 백분병에의 저항성을 85∼95% 증가시키며, 뿌리혹에 의한 작물의 손실을 10배 감소시키고 뿌리썩음병에 대해 방어작용을 한다. 나르시스의 뚜렷한 성장 촉진효과는 얻기 쉬운 질소원에 기인된다. 대조군에 비해 처리된 식물들은 뿌리 길이의 25∼30%, 줄기 높이의 10%, 건조 뿌리량의 75∼80%, 곡물량의 25∼30% 정도를 능가한다. 사용량이 적으며(곡류 종자 1톤당 80g, 해바라기 및 옥수수 종자 1톤당 200g을 사용), 작용 지속시간이 길다. 처리 후 20∼30일 이내에 질병의 진전을 억제하고 식물의 내성을 일으키지 않으며 독성, 광독성이 없고 사람, 동물, 곤충에 안전하며 토양에 축적되지 않고 (단당인 글루코사민으로 분해된다), 살충제나 항진균제와 혼합하여 사용할 수 있다. 종자를 담근 용액에 다른 생물학적 활성물질을 마이크로 용량으로 첨가하면 이 제제의 효능이 증가되기도 한다. 농업식품청의 화학위원회에서 제제 사용에 대해 허가 받았으며, 나르시스제제로 식물 처리할 때에 특별한 보호 조치가 필요 없다."이 방법을 사용하면 식물의 발아능력, 저항력, 뿌리착상능력 향상등으로 곡물 수확량을 증가시킨다
스탠포드의 Haward Hughes 의학 연구소의 Brian Kobilka 박사와 이태원 박사는 G 단백질 신호 전달의 효과를 증진시키는 수단을 발견했다, 그들은 영구적으로 G 단백질 알파 서브유니트(Gsa)를 세포막에 결합시켰다, 융합 단백질을 경유해 결합된 G 단백질 서브유니트(tetGsa)는 앞서 이루어지는 활성화후에 막으로부터 해리되지 않는다, 따라서, 중재되는 신호를 더 효과적으로 증폭시킨다G 단백질 신호 전달 계를 증폭시킬 유일한 계
자연에서 피코빌리 단백질은 매우 효율적인 빛 포획 단백질 형광체이다, 매우 유용한 형광 성질을 보여 주는 강한 색소이다, 450nm와 650nm 사이에서 최대로 빛을 흡수하고 560nm와 66nm에서 최대로 빛을 방출한다, 단일 클론 항체에 결합한 피코빌리 단백질은 면역학과 진단학에 사용된다, 세포나 조직상의 특이적 수용체 부위에 항체가 결합하면 세포나 조직은 빛 조사로 표지된 형광에 의해 감지된다, 두 개나 세 개의 색 표지화가 가능하다, DNA probe의 형광 표지와 분자 그리고 세포의 형광 면역 분석에도 응용 가능하다세포나 조직상의 특이적 수용체 부위에 항체가 결합하면 세포나 조직은 빛 조사로 표지된 형광에 의해 감지된다, 두 개나 세 개의 색 표지화가 가능하다, DNA probe의 형광 표지와 분자 그리고 세포의 형광 면역 분석에도 응용 가능하다
핵산 hybridization probe의 빠른 부착을 도모한 방법이다, 10^4-배 이상으로 상보성 DNA 가닥의 재연결 속도를 증가시킨다, 일반적으로 68℃의 1M NaCl에서 행하는 반응보다 2,000 배 빠른 재연결 속도를 갖는 AlhnRNP 단백질을 사용한 스탠포드 연구자의 초기 개발과 유사하다, 반응 속도는 상보성 가닥이 용액내에서 서로 마주치는 속도에 근접하거나 같으며 재연결은 이중 가닥 DNA의 예측된 해리 온도 이상에서 가능하다, 또한 비상보성 염기 서열의 10^6-배가 과도하게 존재할 때 빨라지며 이형성 DNA와는 상대적으로 독립적이다.일반적으로 68℃의 1M NaCl에서 행하는 반응보다 2,000 배 빠른 재연결 속도를 갖는 AlhnRNP 단백질을 사용한 스탠포드 연구자의 초기 개발과 유사하다, 반응 속도는 상보성 가닥이 용액내에서 서로 마주치는 속도에 근접하거나 같으며 재연결은 이중 가닥 DNA의 예측된 해리 온도 이상에서 가능하다,
Agouti 외피 색깔 유전자(Agrp)와 관련된 새로운 신경 내분비 호르몬을 인코딩하는 유전자, Agrp는 부신과 뇌에서 정상적으로 발현되며 코르티졸 생성의 정상적인 조절 그리고/혹은 체중 조절의 중요한 구성원이다자료 없음