일반기술
생명과학 > 동물자원
포유동물의 수정란에 조직특이적 발현벡터를 도입시키기 위하여 염소의 β-lactoglobulin (BLG)의 5' -조절 부위와 polyadenylation 신호 서열을 갖는 벡터로 삽입하여 제조하였다. 사람 α1-antitrypsin (α1-AT)과 erythropoietin (EPO) 유전자의 genomic 염기서열을 BLG의 5' -조절 부위 서열을 갖는 pBluescript에 각각 삽입하여 p1692g-AT와 p1692epo 벡터를 만들었다. 형질 전환된 유선 세포 HC11에서의 α1-AT 및 EPO mRNA 발현을 확인하였으며, 형질 전환된 유선 세포에서의 α1-AT 및 EPO 단백질 발현 및 분비를 면역블랏 방법으로 확인하였다. 또한 조직특이적 유용단백질 발현 효율증진을 위하여 유선 특이적 actiavtion element를 포함하는 것으로 추정되는 -470∼-740 지역을 Gel-shift 및 Foot-printing 방법으로 분석하여 actiavtion element로 추정되는 -697∼-744 부위를 올리고뉴클레오타이드로 합성하였다. 이 올리고뉴클레오타이드는 BLG의 205 프로모터의 상류에 세벌로 결합되었을 때 205 프로모터를 크게 활성화 시켰을뿐만 아니라, 이 oligonucleotide는 젖 생산 호르몬들을 처리 했을 때 프로모터 활성을 약 6배 정도 증가 시켰다. 이상과 같은 유선 특이적 actiavtion element는 유선 조직-특이적 고활성 프로모터의 제작에 이용될 수 있을 것이다. 이상과 같이 제조된 사람 α1-antitrypsin 과 EPO 유전자 발현용 재조합 DNA를 생쥐 수정란에 미세주사하여 유전자이식 생쥐를 만든 결과 여러 마리의 founder mice를 만드는데 성공하였고, 이 founder mice를 다시 교배시켜 외부 유전자의 삽입이 확인된 유전자이식생쥐 Line을 얻었다. 특별히 EPO 발현 유전자이식생쥐의 line들을 분석한 결과 유전자이식생쥐에서 EPO가 혈액으로 다량을 분비되는 polycythemia와 유사한 phenotype이 발견되었다. 지금까지 얻은 결과들로 미루어 보아 염소의 BLG promoter가 생쥐의 생체내에서 확실히 발현된다는 것을 알 수 있었고, 유전자이식생쥐의 polycythemic phenotype에 의한 교배의 어려움으로 인해 유즙생산을 위해 비교적 오랜 시간이 필요할 것으로 예상되나, 궁극적으로 조직특이적 발현의 개선과 함께 성공적인 유전자이식생쥐의 개발과 유즙 내에서의 EPO 대량생산이 가능하라리 기대된다. 현재 얻은 EPO 유전자이식생쥐는 세계에서 처음으로 개발된 것으로서 유용단백질 생산의 차원을 떠나 polycythemia의 질병모델로도 그 가치가 높이 평가되고 있다.적혈구수, hematocrit, 혈액중 EPO 농도, 거대비장증(splenomegaly) 등 여러 가지가 인간의 polycythemia와 극히 유사하여, 이 질병의 기전연구와 치료를 위한 중요한 실험동물로 쓰일 수 있다
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- 한국생산기술연구원
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- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 동물자원
인체 유용 생리활성 물질 2종 (G-CSF, GM-CSF)의 유전자를 PCR 방법으로 cloning 하였음, 산양(goat) 유선조직에서 특이적으로 발현되는 유전자인 β-casein 유전자의 promoter 부위 (약 2kb)를 cloning하였음, 유선조직특이적 발현 vector 2종을 construction 하였음. G-CSF 및 GM-CSF의 유전자를 산양 유선조직특이적 발현벡터 2종에 각각 subcloning하였음. 한국재래산양에서의 수정란 다배란 유기방법 확립. 외래 유전자 주입을 위한 1세포기 산양 수정란의 채취시기 및 방법을 확립하였음. 체외수정용 난포란의 채취를 위한 호르몬의 적정투여량과 투여방법 확립. 체외수정 및 인공수정에 사용될 정액의 채취방법 확립. 산양 수정란의 체외배양조건 확립. 외래유전자가 주입된 산양 수정란의 체외발달을 시도하여 배양조건을 확립하였음
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- 한국생산기술연구원
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- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 동물자원
인간의 난치병을 정복하기 위해서는 그에 따른 특정질환의 모델이 될 수 있는 실험동물이 요구되며, 이러한 모델동물은 신약개발 과정 중 약효검정 연구를 수행하는데 절실히 필요하게 된다. 본 연구는 질환모델동물에 대한 연구 중 그 1차년도 연구로서 심장순환계 치료제제 개발, 특히 고혈압 제제 개발 연구를 위하여 절대적으로 필요한 자연발생 고혈압 (SHR) 랫트와 인위적으로 고혈압을 유발시킨 신성 고혈압 랫트 (RHR) 에 대한 육종기술 확립, 기초 data 연구, 유발기술 확립 연구 등을 수행하였다. 그 결과 SHR 랫트의 육종을 위한 가계(혈통)도를 확립하였으며, 종축선발 기준을 정착하였고, 번식성적이 최초 개발 당시의 성적과 동일함을 확인하였다. 또한 SHR 랫트의 체중변화, 장기중량변화, 주령에 따른 혈액학적, 혈액생화학적, 뇨생화학적 성상 등에 대한 성적을 확립하였으며, 혈압, 맥박수, 체온, 심전도 등의 data를 확립하였다. 신장 동맥 결찰 수술법을 이용한 RHR 랫트의 착술 기술을 확립하였으며, Renin의 활성도를 측정하여 RHR 랫트 작출법의 성공을 확인하였다. 본 연구를 통하여 SHR 랫트의 육종기술과 대량생산 할 수 있는 기반기술을 갖출 수 있었으며, 기초 data와 RHR 랫트 작출기술을 확립함으로써 향후 약효검정 및 고혈압 연구에 적극 활용될 것으로 사료된다.
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- 한국생산기술연구원
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- 2000-04-07
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생명과학 > 해양생물 (R83)
키토산은 게의 껍질내에 존재하는 키틴을 재처리한 다당의 일종으로 면역증강, 항종양활성, 콜레스테롤 저하, 식물세포의 활성화 등의 기능성을 나타내는 물질로 알려지고 있다. 그러나 키토산은 물에 녹지 않고 생체흡수율이 낮으며 맛이 떫어 각종 식품 첨가물 및 의약품 등에의 이용면에서 크게 제약되어 키토산의 물성을 개량한 키토산 올리고당의 생산기술개발이 요구되어 왔다. 키토산 올리고당의 생산은 산분해법과 효소법으로 대별되는데 산분해는 유해성이 문제로 대두되어 산분해물의 이용에 어려움이 있고 효소적 분해방법의 경우 효소비용 및 반응조절 기술이 어려워 올리고당을 경제적으로 생산하는데 장애가 되고 있다. 본 방법은 키토산 올리고당의 조성을 쉽게 조절하고 생성수율이 높을 뿐만 아니라 생산공정이 간단한 경제적인 생산법을 특징으로 하고 있다. 키토산 올리고당은 특히 건강식품시장에서 1위로 부상할 만큼 유망한 품목이며 연간 300억원 이상의 매출을 올리고 있다.본 방법은 키토산 올리고당의 조성을 쉽게 조절하고 생성수율이 높을 뿐만 아니라 생산공 정이 간단한 경제적인 생산법을 특징으로 하고 있다. 키토산 올리고당은 특히 건강식품시장에서 1위로 부상할 만큼 유망한 품목이며 연간 300억원 이상의 매출을 올리고 있다. 키토산 올리고당의 가격은 25-30만원/kg이나 본 방법의 개발로 키토산 올리고당의 국내 자급은 물론 관련산업에 파급효과가 매우 클 것으로 기대된다.
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- 한국생산기술연구원
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- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 해양생물 (R83)
밀을 기질로 곰팡이를 접종하여 제조한 간장용 상업코지를 대형 멸치육(체장 13cm 이상)에 혼합하고 적절한 발효조건(온도, 습도, 발효시간)에서 발효시킨 멸치조미료 소재 제조기술, 발효가 완료된 멸치 혼합물을 동결건조, 마쇄하여 다시마 등 정미성분이 풍부한 부원료와 재혼합하고 Tea bag에 포장함으로써 사용할 때 편의성을 높인 제품.
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- 한국생산기술연구원
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- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 미생물자원
섬유가공용 내열성 -amylase 고생산성 B. licheniformis 변이주를 개발하여 발효조건을 검토한 결과 현재 생산량이 산업적 수준의 20%에 해당하며, 이로부터 내열성 -amylase 유전자를 크로닝하고 염기배열 분석 및 염색체상의 변이지점을 확인함. 내열성 -amylase 고생산성 변이주와 효소유전자 발현 기작 분석을 위한 -amylase 결손변이 주 B. subtilis를 개발 완료하고 구조유전자 발현용 promoters를 탐색하여 tandem promoter로 개발중임. 핵산계 대사물질의 고생산성 변이주를 다수 확보하고 변이주의 발효조건을 검토하였으며 핵산계 대사물질 생합성에 관여하는 핵심 효소 유전자 (guaA, guaB, purF)를 크로닝하여 분석하였음. Aspergillus의 alkaline protease 유전자 절편 크로닝을 완료하고 염기서열을 결정중임. 발효용 종균으로부터 Aspergillus oryzae, A. sojae 분리하고 숙주균으로 사용가능한 영양요구성 OTC변이주 개발하였으며 promoters와 terminator를 도입하여 염색체 삽입발현벡터를 제조함. 글루타치온 생합성에 관련된 glutamylcyst -eine synthetase 변이 유전자 제조와 특성 분석함. 재조합 대장균의 배양조건을 검토하여 plasmid 안정성 향상을 위한 연구를 진행중이며 고정화 혼합균주를 개발중임. 인간 유래의 lactoferrin 구조유전자를 3 단편으로 나누어 확보하였고 -galactosidase 유전자를 크로닝함. 인간의 분변으로 부터 두 종류 장내세균을 분리하고 lactate 내성변이주로 개발하고 장내분리균과 변이주 발효에 미치는 탄소원과 발효산물의 영향을 규명함 .
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- 한국생산기술연구원
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- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 기타 단백질·탄수화물·지(방)질공학
추출방법으로 음이온 계면활성제와 고농도의 염화나트륨용액에 의한 방법을 사용하였다. 이 방법은 페놀을 사용하는 방법(미국특허 3,838,148)에 비해 공해문제가 없고 방법이 간단하고 시간이 적게 걸리므로 산업적인 생산에 유리하다. 명태로부터 분리된 고니는 진탕기에서 클로이드 상태로 분쇄된 뒤 2mm채를 통과시키고 생리염수에 녹여 원심분리하여 침전물을 모으는 세척 조작을 거쳐 세포핵을 분리한 후 여기에 음이온 계면활성제를 가하여 핵막과 핵단백질을 변성시킨 뒤 2N염화나트륨 용액으로 히스톤을 분리시켜 원심분리하여 변성된 단백질을 제거시키고 1/2부피의 이소프로판올을 가하여 생성된 섬유질을 분리하고 이것을 아세톤으로 씻고 건조시켜 백색의 데옥시리보핵산섬유를 얻는 방법이다. 본 발명에서는 추출방법을 최적화하기 위해서 추출용액의 부피와 사용되는 음이온 계면활성제의 농도에 따른 추출양의 변화를 조사하여 최소의 음이온 계면활성제의 농도에 따른 추출양의 변화를 조사하여 최소의 음이온 계면활성제와 유기용제를 사용하여 최대의 데옥시리보핵산을 추출해내는 방법을 개발하였다.
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- 한국생명공학연구원
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- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 기타 단백질·탄수화물·지(방)질공학
인슐린 유사체를 지령할 수 있는 합성 유전자를 이용하여 합성유전자를 미생물에 형질전환하고 발현하여 기존의 인슐린과 아미노산 배열이 다른 인슐린 유사체를 제공한다. 인체 인슐린의 B사슬의 카르복시 말단에 위치하는 아미노산이 쓰레오닌대신 메티오닌을 지령하는 암호로 대체시킨 인체 인슐린 B사슬의 유전자를 인체 인슐린 A사슬을 지령하는 유전자와 직접 연결되도룩 합성하고, 합성된 유전자를 발현용 플라스미드내에 삽입하여 대장균 단백질의 전반부 또는 후반부의 일부와 융합시키고 이 유전자의 발현을 프로모터로 조절하고 배양한 후, 배양한 배양세포로부터 인슈린 유사체 펩타이드가 융합되어진 형태의 단백질을 추출분리하고, 이를 시안화브롬으로 개열시켜서 인슐린 유사체의 A사슬 펩타이드와 B사슬 펩타이드를 동시에 분리정제시킨 후, 두 사슬의 펩타이드를 디설피드 결합으로 연결시켜 인체 인슐린 유사체를 생산한다.
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- 한국생명공학연구원
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- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 기타 단백질·탄수화물·지(방)질공학
본 발명은 DNA의 화학적 합성에 있어서 필수 소재인 뉴클레오사이드의 포스포아미다이트(Phosphodmidite)를 합성하는 방법에 관한 것이다. 한단계로 합성,수율도 개선시키고 합성시간,조작도 훨씬 신속 간편한 방법이 개발되었음.
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- 한국생명공학연구원
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- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 식물자원
본 발명은 사람 인슐린 단백질의 유전자를 담배에 도입하여 인슐린 단백질을 생산하는 담배 조직,담배 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다. 사람 인슐린 단백질을 생산하는 담배조직(KCTC 8467P) 배양에 사용하였다. 사람 인슐린 유전자의 담배에의 도입과 이에 따른 인슐린의 담배에서의 생성 확인은 mRNA의 분석(노던 분석)과 단백질의 항원/항체 반응 분석(웨스턴 분석)을 함으로써 이루어졌다.
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- 한국생명공학연구원
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- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 효소공학 (H73)
본 발명은 다음 일반식(I)으로 표시되는 효소의 역가수분해 반응을 이용한 당유도체의 제조법에 관한 것으로 특히 당의 C1위치에서 당을 포함하고 있는 알콜류와 효소반응으로 글리코시드 결합을 형성시키므로써 효소 합성 방법에 의해 당 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 당유도체를 제조하는 방법에 화학적인 것과 효소를 이용한 방법 들이 보고되어 있으나 여러 문제점이 있었으므로 탄수화물 유도체의 효소 합성을 유기용매상에서 진행시켜 간단한 방법으로 효소의 입체특이성과 넓은 적용 범위를 가지며 수용액상의 반응의 장점을 갖는 새로운 방법이 연구 되었다. 당의 C1위치에서 당을 포함하는 알콜류의 효소반응으로 글리코시드결합을 형성시키므로써 당 유도체를 제조함에 있어서 유기용매에 불용성인 탄수화물을 상변환체인 유기 붕산을 사용하여 유기용매중에 용해시키고,글리코시드 가수분해효소를 이용하여 역가수분해반응으로 글리코시드 결합을 형성시키므로써 당 유도체를 제조한다. 일반식(I)에서 R은 메틸,에틸,이소프로필, 또는 단당류를 나타낸다. 탄수화물은 단당류,이당류,다당류 중에서 선택된 것이며 유기용매는 친핵반응성이 없는 석유에테르,헥산,옥탄,톨루엔,벤젠,클로로포름,디옥산,아세톤 등을 하나 이상 사용하며 효소로는 탄수화물을 분해하는 글리코시다제,즉 글루코시다제,갈락토시다제 및 만노시다제 중에서 선택된 것을 사용한다.
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- 한국생명공학연구원
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- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 기타 단백질·탄수화물·지(방)질공학
융화 단백질에서 원하는 단백질을 효율적으로 분리 정제하는 방법으로서, 친화 펩티드의 도입으로 물성을 변화시켜 금속염을 이용한 선별 방법으로도 쉽게 이들을 분리, 정제하게 된다. 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 기타의 펩티드나 단백질을 코딩하는 유전자와 융합시켜 생체 내에서 발현시켜 생성된 융합 단백질로 부터 목적 단백질을 분리, 정제하는 방법에 있어서 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 기타의 펩티드나 단백질을 코딩하는 유전자의 연결점에 7-15개의 아미노산을 코딩하는 DNA 서열을 도입하여 기타 펩티드와 단백질 사이에 7-15개로 구성된 친화 펩티드를 생성하고 이에 의한 단백질 물성 변화에 따른 금속염에 대한 친화성의 차이를 이용하는 선별 방법을 포함하는 융합 단밸질로 부터 단백질을 분리,정제할 수 있다.
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- 한국생명공학연구원
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- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 효소공학 (H73)
본 발명은 고온성 균주인 더머스 칼도필러스(Thermus caldophilus) CK24로부터 유래된 새로운 내열성 DNA 중합효소에 관한 것이며 또한 유전자 재조합 대장균을 이용하여 상기 내열성 DAN 중합효소를 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 더머스 칼도필러스 GK24로부터 새로운 내열성 DNA 중합효소를 분리하여 확인한 후 이를 코딩하는 유전자를 클로닝하여 염기 서열을 결정하고 이로부터 상기 단백질의 아미노산 서열을 결정하며 대장균내에서의 발현을 위한 최적화 조건을 구하여 상기 중합효소를 대량으로 제조 및 정제하는 방법에 관한 것이다. DNA 중합효소는 단일 가닥 DNA를 주형으로 하여 뉴클레오티드 삼인을 상보적으로 결합시켜 이중 가닥 DNA의 합성을 촉매하는 효소이다. 이러한 DNA 중합효소는 중온성 균인 대장균을 대상으로 많이 연구되어 왔으며, 이들중 DNA 중합효소 I 는DNA 염기 서열 및 전체 아미노산 서열이 결정되었고, 또한 이 DNA 중합효소 I 의 5'→3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 갖는 아미노 말단 영역을 제거한 클리나우 단편(Klenow fragment)은 삼차구조까지 밝혀진 바 있다(Jocye, C. M. etal., J. Biol, Chem. 257, 1958-1964(1982) ; Jocye, C. M. and Steitz, T. A., Trends Biochem. Sci. 12, 288-292(1987)). 이에 비해 고온성 균주들로부터 생성되는 내열성 DNA 중합효소에 관한 연구는 상대적으로 적었으며, 대표적인 것이 더머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus) YT-1의 Taq DNA 중합효소이다(Lawyer, F. C. et al., J. Bio. Chem. 264, 6427-6347(1989)). 이러한 DNA 중합효소들은 분자 생물학 분야에서 DNA의 염기 서열 결정 및 염기 치환 반응(nick-translation)등 여러 용도로 광범위하게 이용되고 있다. 특히 최근 개발된 DNA 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, 약칭 PCR)은 DNA증폭을 비롯한 각종 유전병 진단에 유용하게 활용되고 있는데, 이 기술의 특징은 55~60℃의 프라이머 어닐링, 72℃에서의DNA 중합 반응 및 94℃에서의 주형 DNA 변성등 세단계 반응과정을 약 30회 정도 반복함으로써 목적 DNA 단편을 증폭시키기 때문에 고온에서 안정한 내열성 DNA 중합효소의 사용이 필수적이다(Erlich, H. A,. PCR Technology, 1989, StocktonPress, New York). 따라서 본 발명은 기존의 Taq DNA 중합효소와의 새로운 내열성 DNA 중합효소를 찾아내고 유전공학 기술에 의한 대량 생산이 가능하게 하여 보다 저렴한 가격으로 상기 효소의 다양한 활용을 가능하게 하는 것을 목적으로 하고 있다.
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- 한국생명공학연구원
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- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 효소공학 (H73)
고온성 균주인써머스써모필러스 HB27로부터 신규한 내열성 TOP DNA 중합효소 유전자를 분리해내고, 그의 뉴클레오티드 서열 및 TOPDNA 중합효소의 아미노산 서열을 밝혔으며, 상기 효소의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조한 후, 그에 의해 형질전환된대장균을 배양하여 TOP DNA 중합효소를 대량 생산하고, 이를 정제함으로써 본 발명을 완성하였다. 본 발명의 목적은 신규한 내열성 DNA 중합효소를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 효소의 유전자를 포함하는 발현벡터 및 그에 의해 형질전환된 대장균을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 대장균을 배양하여 신규한 내열성 DNA 중합효소를 대량 생산하는 방법 및 생산된 중합효소를 효과적으로 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
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- 한국생명공학연구원
- 등록일
- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 효소공학 (H73)
본 발명은 고온성 균주인 더머스 칼도필러스 GK-24 로부터 분리·정제된 고온에서 활성이 큰 내열성 ADP-포도당 합성효소, 그의 제조방법 및 그의 아미노 말단과 내부에서 얻은 단백질 단편의 아미노산 서열에 관한 것으로서, 이들 ADP-포도당 합성효소를 이용하면 ADP-포도당을 경제적으로 얻을 수 있고 본 아미노산 서열을 통해 본 효소의 유전자를 얻는 것도 용이하다.
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- 한국생명공학연구원
- 등록일
- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 효소공학 (H73)
[구성]더머스 칼도필러스(Thermus caldophilus)GK24로 부터 정제된93,000 내지 95,000달톤의 분자량을 갖는 DNA 중합효소인 TcaDNA 중합효소.
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- 한국생명공학연구원
- 등록일
- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 효소공학 (H73)
본 발명은 고온성 균주인 더머스 칼도필러스 GK-24 로부터 분리·정제된 고온에서 활성이 큰 내열성 ADP-포도당 합성효소, 그의 제조방법 및 그의 아미노 말단과 내부에서 얻은 단백질 단편의 아미노산 서열에 관한 것으로서, 이들 ADP-포도당 합성효소를 이용하면 ADP-포도당을 경제적으로 얻을 수 있고 본 아미노산 서열을 통해 본 효소의 유전자를 얻는 것도 용이하다.
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- 한국생명공학연구원
- 등록일
- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 기타 유전자 공학
.유전자 발현정도 조절 소 베타-카제인 유전자및 형질전환된 대장균 .소 베타-카제인 유전자, 재조합 플라스미드, 형질전환대장균
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- 한국생명공학연구원
- 등록일
- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 기타 유전자 공학
항균성을 갖는 한국산 흑염소 유래의 락토페린및 이의 유전자에 관한 것으로, 한국산 흑염소의 유선으로 부터 정제된 락토페린은 염소의 락토페린과는 달리 항균력을 가진다.
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- 한국생명공학연구원
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- 2000-04-07
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일반기술
생명과학 > 기타 단백질·탄수화물·지(방)질공학
.소의 베타 카제인 유전자, 하이브리드 인트론 및 인체 락토페린 유전자를 포함하는 발현벡터의 포유동물 수정란에 주입 형질전환동물 창제 및 락토페린 분리방법
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- 한국생명공학연구원
- 등록일
- 2000-04-07
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