산업기술 통합검색
본기술은 우유 성분을 전혀 함유하지 않고 두유만을 이용하여 제조한 것으로 콜레스테롤을 전혀 함유하지 않고 심혈관계 질환을 유발시키는 포화 지방산을 거의 함유하지 않아 성인병 예방에 좋으며, 저렴한 산업용 효소를 이용하여 효소 처리 하였기 때문에 대량 생산이 가능한 제품이다효소처리 기술을 바탕으로 콩비린내를 제거하였고 기포성, 유화성 질감등을 향상시켰고 인공향과 인공색소를 전혀 첨가하지 않고, 다양한 풍미와 색, 생리활성을 가지는 과채류를 첨가하여 제조하여 건강식품으로 성장성이 기대되는 기술이다
SMB 크로마토그래피를 이용하여 단백질 응집체(inclusion body)를 재접힘시키는 방법으로서, 목적 단백질 시료를, 충진제를 충진시킨 SMB(simulated moving bed) 크로마토그래피 컬럼에 로딩하고 재접힘시키며, 재접 힘 버퍼를 컬럼에 주입하여 재접힘된 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 방법이다. 유전자 재조합 기술에 의해 재조합 단백질의 유용 유전자 산물을 대량생산하려고 하나 대장균에서 생산된 재조합 단백질은 활성이 없는 형태로 응집된 응집체로 존재하는 경우가 많다. 응집체란 단백질 접힘이 제대로 되지 못해 올바른 3차구조가 형성되지 않아 생긴 비수용성의 침전물이 균체내에 생성되는 것이다. 이를 해결하기 위한 단순희석법은 희석하는 과정 때문에 커다란 반응기가 있어야 하고 무작위적인 이황화결합이 발생할 수 있는 단점이 있다. 최근 이를 개선한 회분식 크로마토그래피를 이용한 재접힘 방법은 원하는 버퍼 조성으로 치환이 가능하고 재생이 불완전하게 이루어진 단백질 부분과 재접힘 공정에 사용된 계면활성제 제거가 용이한 장점이 있으나 재접힘 효율이 높지 않아 생산량에 제약이 있고 충진제의 활용성, 용매의 량 등 단점 때문에 대량의 응집체로부터 재접힘 단백질 생산이 불가능하다. 한편 연속식 크로마토그래피 방법인 SMB는 효율적 분리를 위해 연속적 향류를 이용하는 이동층 크로마토그래피를 모사한 방법으로 흡착제와 이동상이 서로 반대 방향으로 이송되며 컬럼의 중간부분에서 유입되는 혼합물은 각 성분의 이동속도 차이에 의해 분리가 이루어진다. 두 물질간의 분리도가 좋지 않아도 두 물질의 농도분포 곡선의 양쪽 끝에서만 분리가 된다면 순수한 물질을 얻을 수 있고, 석유화학제품의 정제에서 출발하여 키랄 화합물의 분리에 의한 의약품의 생산 및 생명공학 제품에도 응용되기 시작하였다. 그러나 아직 단백질의 재접힘에 적용된 보고는 없는 실정이다. 이에 SMB 크로마토그래피를 단백질 응집체의 재접힘 공정에 적용하여 연속적으로 재접힘된 단백질을 얻을 수 있음을 확인하였다.단백질 응집체를 SMB 크로마토그래피를 이용하여 재접힘시키는 방법으로서, 회분식 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있는 모든 단백질에 적용이 가능하고, 본 실시예는 환원 및 변성된 라이소자임을 사용하였다. 재접힘 버퍼, 충진제, 운전조건 등을 변화시켜 모든 단백질의 재접힘 방법에 사용할 수 있고, 효율에 영향을 주는 변수로는 유속과 반응온도가 있으며 효율적으로 하기 위해 컬럼내에서의 충분한 체류시간이 요구되고 유속, 작동온도, 충진제, 이동상 조성에 따라 최적화할 수 있다. 본 SMB 크로마토그래피를 이용한 단백질 재접힘 방법은 기존의 회분식 재접힘 방법을 대체할 수 있고 또 단백질 재접힘에 SMB를 사용하면 부분적인 분리만으로 연속적인 재접힘 단백질을 얻을 수 있다.기존 회분식 크로마토그래피를 이용한 방법에 비해 단위 생산량당 적은 량의 충진제를 이용하고 적은 량의 이동상을 사용하여 고농도의 재접힘된 단백질을 얻을 수 있어 농축 등의 후처리 공정에 드는 비용과 충진제, 이동상 비용을 줄여 재접힘 단백질을 연속적으로 얻을 수 있다. 부분적인 분리만으로도 연속적으로 재접힘된 단백질을 얻을 수 있어 적은 비용으로 높은 생산량을 기대할 수 있고 유용 효소의 생산원가 감소에 기여할 수 있다.유용한 단백질의 분리 기술로서 생명공학제품의 생산에 적용될 수 있으며, 부가가치가 높은 생명공학제품의 시장이 성장함에 따라 본 기술 응용도 성장될 것으로 예상된다.
미생물 배양액으로부터 색소 제거 및 단백질분해효소의 회수방법으로서 세포배양액을 준비, 이온교환수지 흡착제를 첨가한 후 흡착반응시키고, 흡착 반응된 반응 시료로부터 단백질분해효소를 분리하는 단계를 포함하는 회수 방법이다. 미생물을 이용하여 산업용 및 의료용으로 사용하는 단백질분해효소를 생산하는 경우 대두박, 효모 추출물, 펩톤 등의 발효배지를 사용하는데, 배지 성분 자체가 색소를 포함하고 특히 가압 멸균 동안 암갈색화되어 색소가 증가한다. 또 발효하는 동안 미생물 자체에 의해 색소가 생산되어 발효가 끝난 후 색이 짙어지게 된다. 단백질분해효소를 포함하는 단백질을 회수하는 동안 색소는 어느 정도 제거되나 시간이 많이 걸리고 비싼 단점이 있어 많은 양의 색소들이 농축과정 중에 단백질과 함께 농축되고 있다. 따라서 농축된 조효소액으로부터 필요한 단백질을 정제하는 효소를 포함하는 단백질 정제공정에서 색소는 정제용 수지의 상층 부분에 결합하여 수지의 정제 효율을 낮추고 수지의 재사용 및 재현성에 영향을 주어 궁극적으로 최종산물에도 색을 띠게 될 가능성을 갖는다. 따라서 색소의 제거는 단백질의 기능을 높여 주고, 소비자에 대한 거부감을 감소시키는 결과를 가져다 준다. 색소를 제거하기 위해 사용한 활성탄은 큰 내부 표면에 존재하는 탄소원자의 관능기가 주위의 액체 또는 기체를 인력에 의해 미세 세공에 물리적으로 흡착하는 성질이 있어 여러 산업분야에서 BOD 개선, 중금속, 유기용매, 악취, 유해가스 및 색소 등을 제거하는데 폭넓게 사용하고, 또 수돗물과 하수 정화 등의 수처리, 식품공업에서는 탈색, 냄새제거 및 당 정제에 많이 이용되고 있다. 단백질 용액으로부터 색소를 제거하기 위해 활성탄의 사용시 사용 양, 접촉시간 및 접촉 온도 등 여러 가지가 중요하다. 일반적으로 접촉시간이 많고 온도가 높을수록 색소제거 효율이 높으나, 단백질의 회수율은 크게 감소하는 문제점을 가지고 있다. 이에 색소를 제거하기 위해 사용되는 기존의 흡착제가 가진 단점을 극복하기 위해 흡착제 조건을 변화시킨 결과, 합성 이온교환수지를 사용하면 미생물 배양액으로부터 효율적으로 색소를 제거하고, 단백질분해효소를 회수할 수 있음을 확인하였다.흡착제를 이용한 색소 제거방법은 미생물 배양액으로부터 색소를 효율적으로 제거함과 동시에 단백질분해효소를 간단하고 빠르며 높은 수율로 회수할 수 있다. 세포 배양액을 농축하고, 다가알코올 또는 다가 프로필렌글리콜을 2% 첨가하여 열에 의한 단백질분해효소를 안정화시키고, 흡착제로서 2-10%의 이온교환수지 또는 재생 이온교환수지에 의해 교반흡착 또는 컬럼크로마토그래피로 흡착반응을 4-50℃, pH10-11에서 4-16시간 수행하여 단백질분해효소를 정제 및 회수한다.단백질분해효소를 포함하는 미생물 배양액으로부터 높은 효율로 색소를 제거할 수 있고 단백질분해효소 회수율도 높기 때문에 식품, 사료, 직물․천연가죽의 가공, 유기폐기물처리 등 산업적 용도로 사용되는 단백질분해효소를 생산하는데 유용하다.세제 외에 식품, 사료, 직물과 천연가죽의 가공 및 유기폐기물분해 등 단백질분해효소로서 산업 용도로 매우 다양하게 시장을 형성하고 있다. 특히 세제산업은 가장 큰 산업분야로서 본 단백질분해효소는 친환경성의 천연제품이며 세제의 극한 조건에서의 안정성 확보가 가능하므로 시장 확대가 예상된다.
본 발명은 재조합 대장균으로부터 재조합 인간 인터루킨-2를 생산하는데 있어, 사람 글루카곤의 유사 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 신규의 융합파트너로 이용함으로써 배양액 내 안정적 단백질을 생산, 생성된 불용성 응집체의 효과적인 알칼리 용해 및 저분자량의 융합단백질 오리고머생산을 특징으로 하는 제조방법에 관한 것이다. 인간 글루카곤 유래 유사 펩타이드를 융합파트너로 포함하는 X-L-Y형의 융합단백질을 이용하여 재조합 인간 인터루킨-2를 효과적으로 제조하는 방법이다.X:융합파트너(인간 글루카곤 펩타이드 유사체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드)L:링커(코돈을 맞추기 위한 배열 또는 펩타이드 절단효소의 인식배열)Y:재조합 인간 인터루킨-2 보다 상세하게는, 인간 글루카곤 유사체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 융합파트너로 하는 융합단백질을 코딩하는 유전자, 유전자를 포함하는 벡터, 그 벡터로 형질전환된 미생물, 그리고 융합단백질의 제조방법에 관한것으로서 , 본발명에 의하면 분리된 응집체가 변성제 및 환원제등을 사용하지 않고도 쉽게 수용성화될 수 있으며, 재조합 단백질 응집 시의 상호작용으로 인해 저분자량의 올리고머 형태로 재조합 단백질을 얻을 수 있다.
본 기술은 레트로바이러스 벡터를 이용하여 인터루킨-16 유전자를 활발히 분열하는 인체 암세포에 효과적으로 직접 도입하는 최초의 방법이다. 인터루킨-16 유전자를 HSV-tk유전자와 동시에 한 벡터시스템에서 발현시켜 레트로바이러스 벡터의 염색체 삽입에 의한 새로운 암유발을 방지할 수 있다. 인간 인터루킨-16 유전자 및 헤스페스 심플렉스 바이러스(HSV) 티민 카이네이즈 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터, 상기 벡터를 포함하는 레트로바이러스를 생산하는 포장 세포주 및, 상기 인터루킨-16및 티민 카이네이즈를 생산하는 동물 세포주에 관한 것으로서, 본 기술의 레트로바이러스 벡터는 C-말단 분비형 인간 인터루킨-16 유전자, IRES서열 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)티민 카이네이즈 유전자를 포함하는것을 특징으로 한다.
본 기술은 현재까지 발표되지 않는 신규 재조합 단백질 발현벡터 및 발현방법에 관한 것으로서 단일벡터로 배양배지의 조건에 따라 세포성장기에서 상시발현, 유도발현, 및 특별한 발현유도체 없이 세포성장휴지기에서 대량으로 발현할 수 있는 혁신적인 발현벡터 및 방법에 관한 것이다. 본 단백질 발현시스템은 이로 형질전환된 숙주세포에서 효과적인 단백질 생산을 가능하게 한다. 또한 본 발명의 단백질 발현 유도방법은 보다 정교하게 발현을 조절하는 것이 가능할 뿐만 아니라 발현유도체의 종류가 매우 다양할 수 있고, 발현 유도체에 포함된 불순물에 큰 영향을 받지 않으며, 큰 부피의 배양액에서도 즉각적인 발현유도가 가능한 효과가 있다.
1) 오징어 연골을 40 내지 95℃에서 무기강산 수용액과 반응시켜 탈회분 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 처리된 오징어 연골을 75 내지 95℃에서 염기 수용액과 반응시키는 공정을 2회 이상 반복하여 탈단백 처리하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 처리된 오징어 연골을 진공 조건 하에 85 내지 95℃에서 염기 수용액과 반응시키는 공정을 2회 이상 반복하여 탈아세틸화하는 단계 를 포함하는, β-키토산의 제조방법. 1) 오징어 연골을 40 내지 95℃에서 2 내지 5시간 동안 0.5 내지 1 N의 HCL 수용액과 반응시켜 탈회분 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 처리된 오징어 연골을 75 내지 95℃에서 3 내지 5시간 동안 0.5 내지 1 N의 NAOH 수용액과 반응시키는 공정을 2회 이상 반복하여 탈단백 처리하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 처리된 오징어 연골을 진공 조건 하에 85 내지 95℃에서 3 내지 5시간 동안 35 내지 45%의 NAOH 수용액과 반응시키는 공정을 2회 이상 반복하여 탈아세틸화하는 단계 를 포함하는, Β-키토산의 제조방법.오징어 연골로부터 베타-키토산을 제조하는 방법 (PROCESS FOR THE PREPARATION OF β-CHITOSANS FROM SQUIDCARTILAGES) 본 발명은 오징어 연골로부터 β-키토산을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 오징어 연골을 온화한 조건으로 탈회분 및 탈단백 처리한 후, 진공 조건 하에 온화한 조건으로 탈아세틸화하는 본 발명의 방법에 의하면, 우수한 물성의 β-키토산을 대량으로 제조할 수 있으며, 이로부터 고기능성의 β-키토산 올리고당을 제조할 수 있다
소량의 생물학적 샘플에서 항체와 면역분석법의 체계적인 방법을 설정하고 RIA 또는 ELISA 등의 enzyme linked immunosorbent 분석법을 이용하여 혈청등의 소량의 생물학적 샘플에서 MTA 농도를 측정하므로써 악성종양, 암, 백혈병 세포 등의 진단을 위한 면역분석방법을 제공함매우 특이적인 반응을 하는 항체반응을 이용함으로 분석의 정확도를 높임.매우 소량(fmole)의 물질도 측정 가능함
본 발명은 5-데옥시-5-메틸티오아데노신(MTA) 항체를 이용한 스퍼미딘 및 스퍼민 신타아제 효소의 신규한 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명은 스퍼미딘 및 스퍼민 신타아제 반응의 부산물로 형성된 MTA 측정에 기초를 둔 면역분석방법에 관한 것으로서 낮은 효소농도를 갖는 세포에도 높은 민감도를 나타내므로 짧은시간내에 정확한 분석결과를 얻을 수 있는 뛰어난 효과가 있다.본 발명의 스퍼미딘 및 스퍼민의 면역분석방법은 MTA 측정을 통해 분석하므로서 폴리아민옥시다아제의 저해작용에 영향을 받지 않는다.
본 발명은 전사조절에 필요한 전사조절 매개체(mediator)와 관련된 신규한 단백질 및 그의 유전자에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 초파리로부터 분리된 전사조절 매개체의 구성요소가 되는 신규한 단백질들인 dMED21, dMED23, dMED24, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 그리고 다른 생물체에 존재하는 상기 단백질의 상동 단백질 및 그의 유전자에 관한 것이다.유전자 발현 조절을 가능하게 하는 도구 개발
대부분의 제약과 관계된 생체 분자는 종 특이성이 있는 탄수화물 사슬을(성장 요소, 시토킨, 호르몬, 항체등) 가지는 단백질 이다. 현재 이런 단백질들은 주로 박테리아나 효모에서 생산되고 있다. 이러한 분자들은 글리코실화가 결핍되어있거나 관계없는 이질 탄수화물 구조를 가지고 있다. 이러한 단백질 발현을 위한 또 다른 접근방법은 설치류의 동물 세포 라인을 이용하는 것인데 그러나 이러한 형태의 글리코실화가 중요한 sialylation의 결핍과 더 낮은 활성도를 가지는 non-human 당, 적합하지 않은 혈청 반감기와 면역성을 가지는 효모에서의 글리코실화보다는 인간 글리코실화와 훨씬 유사하다. 한 가지 두드러진 문제는 현재의 생산물은 반감기가 짧고 이것은 화학적으로 변형된 생체분자에 의해 때때로 태클 당할 수 있다는 것이다. 이러한 변형된 생산물은 대부분은 대량으로 in vitro에서 활성도가 감소되며 때로는 위에서 언급한 적합하지 않은 면역성, 낮은 활성도 그리고 심각한 부작용등의 유사한 문제들도 발생한다. 분명하게 이러한 문제들의 해결방법은 human 분자를 완전히 해석하는데 있다. GlycoExpress TM은 완전한 human 글리코실화와 최상의 sialyation을 하는 당단백질을 생산하기 위한 발현 시스템이다.GlycoExpress TM은 보다 높은 생물학적 활성도를 가지는 생약학 물질을 생산하기 위한 발현 시스템이다. GlycoExpress TM은 단백질이 완벽하게 human 글리코실화 될 수 있도록 한다. 활성도, 혈청 반감기, 안정도 항원성과 면역성에서 최적화를 가진다. * GlycoExpress TM 은 최적의 생물공학적인 특성 : 부유 배양, 15-24시간 doubling time, 세포 복제와 분자 생물학적 변형이 쉬움, 많은 양의 분비된 당단백질 생산, 비혈청과 비바이러스 막 단백질의 용해 조각을 포함, origin과 형질 변환
* 원리 와 구성 타겟 단백질을 과발현하여 정제하는 단계, 환자, 정상인 샘플 또는 세포주에서 단백질 추출물을 조제하는 단계, 정제된 타겟 단백질을 단백질 추출물에 혼합하여 단백질간 결합을 유도하는 단계, 결합된 단백질들을 이차원 또는 비이차원 전기영동을 수행하는 단계 및 전기영동 결과 차별적으로 나타난 모든 단백질 스팟들을 MALDI-TOF나 MS-MS를 이용하여 확인하는 단계를 포함하는 타겟 특이적 상호작용 단백질 발굴 방법.* 개발배경기존의 이차원 전기영동에서 나타나는 스팟(spot)들은 세포 혹은 조직 내의 단백질들의 발현, 변형, 분해 등에 의한 변화를 모두 포함하기때문에, 단백질 스팟들의 본성에 대한 규명이 어려움이 따르며, 또한 그 수많은 단백질 중에서 어떤 특징적인 의미를 지니는 단백질 즉 표적 특이적(target specific)인 단백질 발굴은 매우 어려우며 중요한 기술적인 문제로 남아있다.* 중요성및 독창성타겟 단백질과 신호전달물질 처리 유무 혹은 질병유무의 세포에서 단백질 얻은 단백질 추출물을 혼합하여 타겟단백질에 특이적으로 결합이 변화되는 특이 단백질을 발굴하는 방법에 관한 것이다.* 적용제품 및 관련시장신규 단백질을 발굴* 주요적용제품신규 단백질을 발굴* 특징및 장점타겟 단백질과 단백질 추출물을 혼합하여 타겟 특이적 상호작용을 하는 단백질을 발굴하는 방법에 관한 것으로 질병 특이적 혹은 신호 의존 형태로 변화되는 단백질을 발굴 할 수 있을 뿐 아니라 유전자발현에 의한 단백질의 변화 가능성을 배제 할 수 있으며, 변형 변화에 의한 단백질로 한정하여 신규 단백질을 발굴 할 수 있는 효과가 있다. 신호전달 유.무 혹은 질병 유무에 따라 연구자들이 대상으로 하는 타겟단백질에 결합이 변화되는 단백질을 발굴하는 방법을 제공한다.
본 발명은 이온성 액체를 이용하여 단백질을 재접힘시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 재접힘시키고자 하는 단백질 시료를 준비하는 단계 및 이온성 액체를 포함하는 재접힘 버퍼를 이용하여 단백질을 재접힘시키는 단계를 포함하는 이온성 액체를 이용하여 단백질을 재접힘시키는 방법에 관한 것이다.본 발명에 따른 단백질 응집체를 재접힘시키는 방법은 종래의 공정에서 사용되는 용매를 대체할 수 있으며 또한, 이온성 액체의 특이적인 성질을 이용할 경우 분리 및 정제에도 효과를 볼 수 있어 산업발전에 이바지 할 수 있다.본 발명은 단백질을 재접힘시키는 방법에 있어서, 재접힘시키고자 하는 단백질 시료를 준비하는 단계 및 이온성 액체를 포함하는 재접힘 버퍼를 이용하여 단백질을 재접힘시키는 단계를 포함하는 이온성 액체를 이용하여 단백질을 재접힘시키는 방법을 제공한다.본 발명에 의하여 재접힘시키고자 하는 단백질의 종류에는 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 단순희석법 또는 회분식 크로마토그래피 등에 의해 분리될 수 있는 모든 단백질에 적용이 가능하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 재접힘시키고자 하는 단백질 시료로서 환원 및 변성된 라이소자임(lysozyme)을 사용하였다. 또한, 단백질 재접힘 버퍼로는 Tris-HCl(pH 8.2), EDTA, 환원된 글루타치온, 산화된 글루타치온으로 구성되는 버퍼에 하기의 이온성 액체를 포함하는 것을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 상기 재접힘 버퍼는 단백질의 재접힘 효율을 최적화하고 올바른 이황화결합을 형성시키기 위해 첨가제로서 변성제 또는 환원제를 포함하는 것이 바람직하다.본 발명에 따른 상기 이온성 액체는 친수성 이온성 액체인 것이 바람직하다. 소수성 이온성 액체이더라도 온도, 다른 이온의 농도 등에 따라 물에 녹는 현상을 나타내므로 본 발명에 따른 이온성 액체를 포함하는 재접힘 버퍼로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트(Emim[BF4]), 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 트리플루오로메탄설포네이트(Emim[CF3SO3]), 1-에틸-3-메틸이미다졸륨 메틸설페이트(Emim[CH3SO4]) 또는 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트(Bmim[BF4])에 있어서, 앞의 세가지 이온성 액체는 친수성 이온성 액체이고 뒤의 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 테트라플루오로보레이트(Bmim[BF4])는 온도에 따라서 친수성과 소수성 성질을 모두 갖는 이온성 액체이다.
본 기술은 엘라스타제에 대한 저해 능력과 선택성을 향상시킨 거머린(GUAMERIN) 펩타이드의 변이체에 관한 것으로, 서열 1에 기재된 아미노산 서열에서 36 번째 메티오닌이 메티오닌 이외의 아미노산, 바람직하게는 알라닌 또는 발린으로 치환된 거머린(GUAMERIN)의 변이체는 천연상태의 거머린에 비해 엘라스타제에 대한 저해 활성은 증가되고 카이모트립신에 대한 저해 활성은 감소되어, 결과적으로 엘라스타제에 아주 높은 저해 능력을 보이면서 다른 생체내의 단백질 가수분해 효소에 대해서는 선택성을 보이게 되므로, 엘라스타제 과다분비에 의해 야기되는 여러 가지 질병에 대한 치료제로 개발이 가능하다.서열 1에 기재된 아미노산 서열에서 36 번째 메티오닌이 메티오닌 이외의 아미노산으로 치환된 거머린(GUAMERIN)의 변이체. 엘라스타제에 대한 저해 능력과 선택성을 향상시킨 거머린(GUAMERIN) 펩타이드의 변이체에 관한 것으로, 서열 1에 기재된 아미노산 서열에서 36 번째 메티오닌이 메티오닌 이외의 아미노산, 바람직하게는 알라닌 또는 발린으로 치환된 거머린(GUAMERIN)의 변이체는 천연상태의 거머린에 비해 엘라스타제에 대한 저해 활성은 증가되고 카이모트립신에 대한 저해 활성은 감소되어, 결과적으로 엘라스타제에 아주 높은 저해 능력을 보이면서 다른 생체내의 단백질 가수분해 효소에 대해서는 선택성을 보이게 되므로, 엘라스타제 과다분비에 의해 야기되는 여러 가지 질병에 대한 치료제로 개발이 가능
본 기술은 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 다각체 단백질-목적 단백질 융합체, 이를 코드하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 발현벡터로 형질전환된 형질전환 대장균 세포, 형질전환 대장균 세포를 이용한 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 제조방법, 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 이용한 목적 단백질의 제조방법 및 목적 단백질의 안정화 방법에 관한 것이다.본 기술의 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질과 목적 단백질이 융합된 다각체 단백질-목적 단백질 융합체에 의하면,1) 목적 단백질이 안정화되고, 대장균에서 발현될 경우, 응집체의 형태로 발현되므로 분리정제의 관점에서 유리하다.2) 본 기술의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드에 의하면, 상기 단백질-목적 단백질 융합체를 코드할 수 있다.3) 본 기술의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현용 벡터에 의하면, 상기 단백질-목적 단백질 융합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 중에서 발현시킬 수 있다.4) 본 기술의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현용 벡터로 형질전환된 숙주세포에 의하면, 상기 단백질-목적 단백질 융합체를 발현하여 생산할 수 있다. 5) 본 기술의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체의 제조방법에 의하면, 분리정제 과정을 효율적으로 진행시킬 수 있어 효율적이다.6) 본 기술의 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 이용한 목적 단백질의 제조방법에 의하면, 다각체 단백질-목적 단백질 융합체를 효율적으로 분리정제하고, 이를 다각체 단백질과 목적 단백질로 선택적으로 분리시키므로써 효율적으로 생산할 수 있다. 7) 본 기술의 목적 단백질의 안정화 방법에 의하면, 목적 단백질의 N 말단에 배큘로바이러스 유래의 다각체 단백질을 부착시키므로써 목적 단백질을 안정화시킬 수 있다.
○ 기술발명의 목적: 효모 발현 시스템을 이용한 인터루킨-18 단백질의 생산방법○ 기술 요약 및 특징: (a) GPD 프로모터(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GenBank accession number M13807) 또는 AG 프로모터(GenBank accession number J01314), (b) 세포외 분비신호서열, (c) 사이토카인 유전자 및 (d) 전사종결신호 서열을 포함하는 벡터, 이를 포함하는 형질전환주 및 재조합 인터루킨-18 단백질을 제공한다. 본 발명의 재조합 인터루킨-18 단백질은 바이러스 및 세균감염에 대한 면역증가용 조성물, 항암조성물로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 인터루킨-18 항체제조를 위한 항원으로 사용할 수 있다.○ 색인어: 효모, 사이토카인, 인터루킨-18본 발명은 (a) GPD 프로모터(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GenBank accession number M13807) 또는 AG 프로모터(GenBank accession number J01314), (b) 세포외 분비신호서열, (c) 사이토카인 유전자 및 (d) 전사종결신호 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.또한 본 발명은 상기의 벡터를 포함하는 형질전환주를 제공한다.또한 본 발명은 상기의 형질전환주에서 발현된 재조합 단백질을 제공한다.또한 본 발명은 (a) 이종유전자를 GPD 프로모터(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GenBank accession number M13807) 또는 AG 프로모터(GenBank accession number J01314), 세포외 분비신호서열 및 전사종결 신호를 포함하는 벡터에 도입하여 재조합 벡터를 제조하고, (b) 상기 재조합 벡터를 효모에 형질전환하고 및 (c) 형질 전환된 효모를 배지에서 배양하여 이종단백질을 생산하는 것을 포함하는 효모발현시스템을 제공한다.사이토카인을 최적으로 발현시킬 수 있는 시스템을 연구하여, 효모시스템을 확립하였다. 본 발명의 효모시스템은 외부 단백질을 쉽게 세포외로 다량 발현시킬 뿐만 아니라 신체 안전성이 공인되어 있어 발현된 재조합 단백질을 안전한 시료로 사용할 수 있다. 또한 생산된 재조합 단백질은 기존의 미생물에서 발현된 재조합 단백질에 비하여 월등한 생물학적 활성을 가진다.효모시스템에서 외부 단백질을 효과적으로 발현시킬 수 있는 벡터는 프로모터, 세포외분비신호 서열, 사이토카인 유전자 및 전사종결신호서열을 포함한다. 상기 프로모터, 세포외 분비신호서열, 전사종결신호서열은 효모에서 기능을 가지는 통상의 서열을 사용할 수 있다. 바람직한 프로모터는 GPD 프로모터(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter, GenBank accession number M13807) 및 AG 프로모터(하이브리드 프로모터: upstream activating sequence (UAS) of ADH2 (alcohol dehydrogenase 2 + GPD, GenBank accession number J01314)이고, 세포외분비신호는 아밀레이즈 1A 서열(amylase 1A ; 이하 Ramy1A 라 함, GenBank accession number X16509)이다. 바람직한 전사종결신호서열은 GAL7 (galactose-1-P uridyl transferase, GenBank accession number M12348)이다.
본 발명은 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 카탈라아제(catalase)의 프로모터 및 이를 이용한 재조합 단백질 생산에 관한 것으로, 본 발명에 따른 카탈라아제 프로모터는 강력한 유도적 발현 프로모터로서 메탄올 및 메탄올 대사 관련 대사물에 의하여 정교하게 발현이 유도될 뿐만 아니라 낮은 농도의 포도당에서도 발현되므로 한세눌라 폴리모르파에서 외래 단백질을 발현시키는데 매우 유용하다.○기술성 메탄올 및 메탄올 대사 관련 대사물에 의하여 정교하게 발현이 유도될 뿐만 아니라 낮은 농도의 포도당에서도 발현되므로 현재 이용되고 있는 MOX와 FMDH 프로모터를 대체할 차세대 신규 프로모터○사업성 본 발명은 신규 프로모터 개발이 가능한 마이크로어레이 기반의 총체적 평가 시스템을 개발하였으며,이로부터 신규 프로모터를 발굴.따라서 신규 프로모터 개발은 재조합 단백질 개발 및 미생물유전체 정보의 산업적 응용과 관련해 핵심기술로 평가됨.본 발명으로부터 파생하여 다수의 고유한 글로벌형 프로모터 개발이 용이
본 발명은 한세눌라 폴리모르파 HpOCH1 유전자를 포함한 핵산분자,이에 의해 암호화된 폴리펩타이드,한세눌라 폴리모르파 HpOCH1 유전자의 돌연변이로 인해 당단백질의 과당화가 방지되는 한세눌라 폴리모르파 변이주 또는 자연 돌연변이주,이 한세눌라 폴리모르파 변이주 또는 자연 돌연변이주에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여 제작된 외래 단백질을 발현하는 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주,이 균주를 외래 단백질이 발현되도록 하는 조건하에서 배양하고 배양물로부터 외래 단백질을 분리함을 포함하여,외래 단백질을 제조하는 방법에 관한것이다○기술성메탄올자화 효모인 한세눌라 폴리모르파에서 보다 인체에 적합한 재조합 당단백질을 생산하기 위한 시스템을 개발하기 위한 것 ○사업성본 발명은 한세눌라 폴림르파느 SDMLFYDYD 재조합 단백질 대량생산을 위한 숙주로 각광을 받고 있으므로 의약산업상 매우 유용하다
본 발명은 돼지 로타 바이러스의 VP6 단백질을 특이적으로 인식하여 결합할수 있는 단일클론 항체,이 항체를 분비하는 융합 세포주,이 융합 세포주를 이용하여 상기 단일클론 항체를 제조하는 방법 및 상기 단일클론 항체를 이용하여 돼지 로타바이러스를 검출하는 방법에 관한 것으로,본 발명의 단일클론 항체들은 돼지의 분비물 샘플검사에서 돼지 로타바이러스의 감염여부를 정확학고 신속하게 진단 할 수 있어 로타바이러스의 전파경로 확인과 조기발견에 의한 방역효과를 높일 수 있으며,돼지 이외의 모든 포유동물의 로타바이러스에 대해 특이적인 반응성을 가지므로 포유동물의 생리활성,분화 및 성장조절을 연구하는 기초 생물학 연구의 좋은 수단으로 이용될 수 있다○기술성 본 발명은 돼지 로타바이러스의 VP6 단백질을 특이즉으로 인식하는 단일클론항체, 이를 생산할 수 있는 융합세포주 및 상기 융합 세포주를 배양하여 상기 단일클론 항체를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것,또 상기 단일클론 항체를 이용하여 돼지 로타바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다○사업성 본 발명의 로타 바이러스의 VP6 단백질에 대한 생쥐 단일클론항체,이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 이용하면,돼지의 분비물 샘플검사에서 돼지 로타바일스 감염여부를 정확,신속,편이하게 진단할수 있어 로타바이러스의 전파경로 확인과 조기발견에 의한 방역효과도 높일 수 있다. 또한 본 단일클론항체는 돼지 로타바이러스에 대한 백신도 사용할 수 있다
본 발명은 대장균의 아세트산 대사경로를 부분 억제하는 안티센스 유전자를 포함하는 벡터 및 전기 벡터로 형질전환된 대장균에서의 재조합 단백질 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 본 발명은, 아세트산 생성에 관여하는 두 가지 효소인 아세트산 인산화 효소 A(acetate kinase A, ackA) 및 포스포트랜스아세틸라아제(phosphotransacetylase, pta)의 안티센스(antisense) 유전자 발현을 통해 아세트산 대사 효소의 발현을 mRNA 수준에서 부분 억제시키는 벡터 및 이를 이용한 재조합 단백질 생산방법에 관한 것이다.; 본 발명에 따르면, 재조합 단백질 생산용 대장균을 고농도로 배양할 때 2차 대사산물인 아세트산의 과량 배출로 야기되는 재조합 단백질 생산 저하 및 세포성장 저해 문제를 해결하여 기존의 방법과 달리 재조합 단백질의 종류에 관계없이 고수율로 발현시킬 수 있으며 공정적 접근방식에 의한 고비용의 문제를 근본적으로 해결할 수 있다. 또한, 포도당 배지로 인한 아세트산 배출에 의한 세포 성장 저해 및 단백질 생산성 저하를 해결함으로써 낮은 생산비로 고가의 단백질을 대량생산할 수 있는 경제적 파급효과가 클 것으로 기대된다. 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 안티센스-ackA(antisense-acetate kinase A) 유전자.