일반기술
생명과학 > 미생물자원
본 기술은 발효법에 의해 L-글루타민을 제조함에 있어서, 균체의 생육도를 조절하면서 L-글루타민의 균체외 분비능을 증가시키고, 다량의 L-글루타민을 배양액내에 축적시키는 발효에 의한 L-글루타민의 새로운 제조방법에 관한 것이다.L-글루타민은 L-글루타민산 계열 아미노산의 일종으로, 최근 들어 세포재생능력에 효과가 있는 것으로 확인되면서 화장품원료로 수요가 늘고 있으며 노화방지에 대한 연구도 계속되고 있다. 그밖에도 L-글루타민은 영양제, 소화기궤양 치료제, 알콜중독 치료제, 뇌기능 향상제 등 의약용으로 꾸준히 이용되어 오고 있다. 본 기술에서는 L-글루타민을 배양액내에 다량 축적시키는 코리네박테리움 글루타미쿰 (KFCC-10694) 균주를 이용하여 발효법에 의해 L-글루타민을 제조함에 있어서, 배지중의 인산농도를 조절하여 균체의 생육도를 조절하면서 L-글루타민의 균체외 분비능을 증가시키고, 베타인을 배지에 첨가하여 인산농도의 저하로 인해 균체가 받는 삼투압작용에 저항력을 갖게 하여 균체가 다량의 L-글루타민을 배양액에 축적될 수 있도록 하였다본 기술에서는 글루타민 생산성을 향상시키기 위해 인지질의 구성 초기물질이 배지에 첨가되는 인산이라는 점에 착안하여 인산의 초기 첨가농도를 조절함으로써, 균체내에서 생합성된 인지질의 세포막 형성을 줄여주고 세포막 형성 부족으로 나타나는 내삼투압의 저하영향을 보완해주기 위한 삼투압 내성제를 배지에 첨가함으로써 목적생산물인 L-글루타민의 체외 분비능을 향상시킬 수 있는 방법을 알아내었다.즉, 인산농도의 절대량이 부족하면 세포막의 구성성분인 인지질의 생합성이 저해되고 이에 따라 균의 삼투압저항 능력이 상실되나, 세포막 구성에는 영향이 없으면서 삼투압 내성을 갖게 하는 물질로 베타인을 선정하여 이를 인산농도가 감소한 배지에 일정량 첨가하여 배양한 결과, L-글루타민의 생산량이 상당히 증가됨을 알 수 있었다
- 보유기관
- 특허법인충정
- 등록일
- 2001-06-20
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일반기술
생명과학 > 미생물자원
본 기술은 브레비 박테리움 암모니아 게네스의 특수한 변이주에 의해서 탄소원 및 질소원, 기타 미생물에 유용한 유기 및 무기영양원을 함유하는 배지에서 호기적인 배양을 하여 5-크산틸산을 공업적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.본 기술의 목적은 5-크산틸산의 생산능이 우수한 균주를 검색하는 것이며, 이미 브레비박테리움 암모니아게네스의 특수한 변이주 MW-4768-8이 개발된 바 있는데, MW-4768-8주는 발효진행중 복귀변이주가 발생한다는 것이 발견되어, 복귀변이주가 발생하지 않는 유전적으로 안정된 균주의 개발에 의해서 생산성을 더욱 향상시키고자 하였다.본 기술에서의 변이주 브레비박테리움 암모니아게네스 MW-4768-2471주가 친주 및 종래의 여러 변이주와 특별히 다른 생리학적 특성은 아데닌 생육촉진, 구아닌 요구성, 라이소자임 감수성, 슬파구아니딘 내성을 가지고 있다는 점, 장시간의 액체배양에 의해서도 복귀 변이주가 전혀 발생하지 않는 유전적으로 안정된 균주로서 5-크산틸산의 생산성이 대단히 높다는 점으로 요약될 수 있다5-크산틸산은 핵산 생합성 대사과정의 중간물질로 정미성을 가지고 있으며, 특히 핵산조미료로 많이 사용되는 5-구아닐산의 제조에 전구물질로 사용된다. 종래 5-크산틸산의 미생물에 의한 제조 방법은 대부분의 미생물 변이주들이 5-크산틸산이외의 핵산물질 5-이노신산, 히포크산틴, 구아노신, 크산틴, 크산토신 등을 다량 부생시키거나 생산능이 낮았다. 본 기술의 특수한 변이주 MW-4768-2471을 효과적으로 분리한 변이처리 및 선별방법은 다음과 같다. MW-4768-871주를 30℃, 12시간 배양한 균체를 인산 완충액에 잘 현탁시킨 후 자외선 등으로 조사하고, 배지에 30℃에서 7일간 배양한다. 생육한 균집락을 취하여 각각 배지에 식균한 후 30℃에서 5일간 진탕 배양후 흡광도 조사에 의해서 생육도를 조사한다. 이중 생육이 가장 적은 균주만을 선발하여 다시 슬파구아니딘 내성 및 변이복귀 발생여부를 조사한 후 생산능 시험에 의해서 생산능이 가장 우수한 본 기술의 변이주 MW-4768-2471이 최종 분리되었다.배양 종료후 이미 알려진 이온교환 수지처리 혹은 활성 탄소에 흡착, 용리하므로 배약액에서 5-크산틸산을 회수할 수 있다
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- 특허법인충정
- 등록일
- 2001-04-07
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일반기술
생명과학 > 미생물자원
본 기술은 에쉐리시아콜리(Escherichia coli)의 특수한 변이주를 탄소원, 질소원, 기타 미생물에 유용한 유기 및 영양원을 배지에서 호기적인 배양을 하여 L-페닐알라닌을 배지중에 고농도로 축적시키는 L-페닐알라닌의 공업적 제조방법에 관한 것이다.L-페닐알라닌은 필수아미노산의 일종으로 의약품원료, 혹은 저칼로리 감미료인 아스파탐의 합성원료로 사용되는 물질이다. L-페닐알라닌은 미생물의 생합성 경로가 복잡하고, 구조식중 방향족환을 가지고 있어 생성수율은 일반적으로 대단히 낮다. 또한 배지중에 고가의 L-타이로신 등을 첨가하여 주거나 생육이 불량하여 발효가 지연되는 등 많은 단점이 있었다.따라서, 본 기술의 목적은 종래의 이러한 단점을 해결하여, L-페닐알라닌의 생산성이 우수한 균주를 제공하는 것이다.본 기술에서는 에쉐리시아 콜리 K-12주로부터 변이된 L-타이로신, L-트립토판 동시 요구성 및 L-페닐알라닌 아날로그 물질에 대한 내성 변이주, MWEC-101주를 모주로 하여 L-페닐알라닌 생산성이 향상된 특별한 생리적 성질을 가지는 균주를 개발하였다본 기술에서는 본원균주의 모주 MWEC-101주가 생육에 L-타이로신 및 L-트립토판을 필요로 하여 생산배지에 고가의 이들 물질을 다량 첨가하여 주어야 하는 점, 생육이 불량하여 장시간의 발효시간이 필요한 점, 발효액중에 생산된 L-페닐알라닌에 의해 생육이 저해되어 생산성이 낮아지는 점 등의 결점을 해결하기 위하여 모주 MWEO-101주를 여러 단계의 변이 처리를 하여 생육에 L-타이로신 및 L-트립토판을 요구하지 않는 영양요구성 복귀 변이주를 만든 후 L-페닐알라닌, L-타이로신, L-트립토판 아날로그 물질에 대한 내성을 한층 강화시킨 균주중에서 L-페닐알라닌 생산성이 우수한 균주를 선별하였다.본 기술의 균주 에쉐리시아 콜리 MWEC 101-5주가 나타내는 종래의 L-페닐알라닌 생산균주와 다른 특이한 생리적 성질은 생육에 L-타이로신 및 L-트립토판을 요구하지 않는 영양 요구성 복귀 변이주인 점, 기초배지중에 첨가된 L-바린에 의해서 생육이 저해되는 L-바린 감수성인 점, L-쓰레오닌 및 L-메티오닌에 의해서 생육이 촉진되는 점, L-페닐알라닌, L-타이로신, L-트립토판의 아날로그 물질들에 대한 고농도의 내성을 가지고 있는 점으로 요약될 수 있다
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- 특허법인충정
- 등록일
- 2001-04-07
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생명과학 > 미생물자원
본 기술은 에쉐리시아 콜리(Escherichia coli)의 특수한 변이주를 탄소원, 질소원, 기타 미생물에 유용한 유기 및 영양원을 배지에서 호기적인 배양을 하여 L-페닐알라닌을 배지중에 고농도로 축적시키는 L-페닐알라닌의 공업적 제조방법에 관한 것이다. L-페닐알라닌은 필수아미노산의 일종으로 의약품원료, 혹은 저칼로리 감미료인 아스파탐의 합성원료로 사용되는 물질이다. L-페닐알라닌은 미생물의 생합성 경로가 복잡하고, 구조식중 방향족환을 가지고 있어 생성수율은 일반적으로 대단히 낮다. 또한 배지중에 고가의 L-타이로신 등을 첨가하여 주거나 생육이 불량하여 발효가 지연되는 등 많은 단점이 있었다.따라서, 본 기술의 목적은 종래의 이러한 단점을 해결하여, L-페닐알라닌의 생산성이 우수한 균주를 제공하는 것이다.본 기술의 균주는 에쉐리시아 콜리 K-12주로부터 변이된 L-타이로신, L-트립토판 동시 요구성 및 L-페닐알라닌 아날로그물질에 대한 내성변이주 MWEC-101주를 모주로 하여 본 기술상의 방법에 의해서 개발된 L-페닐알라닌 생산성이 향상된 특별한 생리적 성질을 가지는 균주이다본 기술에서는 본원 균주의 모주 MWEC-101주가 생육에 L-타이로신 및 L-트립토판을 필요로 하여 생산 배지에 고가의 이들 물질을 다량 첨가하여 주어야하는 점, 생육이 불량하여 장시간의 발효시간이 필요한 점, 발효액중에 생산된 L-페닐알라닌에 의해 생육이 저해되어 생산성이 낮아지는 점 등의 결점을 해결하기 위하여 모주 MWEC-101주를 여러 단계의 변이처리를 하여 L-타이로신 및 L-트립토판을 요구하지 않는 영양요구성 복귀변이주를 만든 후 L-페닐알라닌, L-타이로신, L-트립토판아날로그 물질에 대한 내성을 한층 강화시킨 균주중에서 L-페닐알라닌 생산성이 우수한 균주를 선별한 후 다시 변이처리하므로 L-페닐알라닌의 생산균주로서 보다 우수한 효과적인 균주를 개발하였다.본 기술의 균주 에쉐리시아 콜리 MWEC 101-5주가 나타내는 종래의 L-페닐알라닌 생산균주와 다른 특이한 생리적 성질은 생육에 L-타이로신 및 L-트립토판을 요구하지 않는 영양 요구성 복귀 변이주인 점, L-바린 내성주인 점, L-페닐알라닌, L-타이로신, L-트립토판의 아날로그 물질들에 대한 고농도의 내성을 가지고 있는 점, 배양온도에 대한 감수성을 가지며 니코틴산에 생육이 현저히 촉진되는 점으로 요약될 수 있다.
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- 특허법인충정
- 등록일
- 2001-04-07
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일반기술
생명과학 > 미생물자원
본 기술은 L-페닐알라닌의 생합성에 관여하는 유전자가 재조합된 새로운 미생물에 의해서 통상의 배양방법으로 L-페닐알라닌을 제조하는 방법에 관한 것이다. L-페닐알라닌은 필수 아미노산의 일종으로 의약품 혹은 저칼로리 감미료인 아스파탐의 합성원료로 사용되는 물질이다. 종래 L-페닐알라닌 제조방법으로는 브레비박테리움 혹은 코리네박테리움속 미생물의 타이로신 요구성 변이주에 의한 방법과 에쉐리시아 콜리의 타이로신 요구성에 트립토판 아날로그 내성 변이주에 의한 방법 등이 있다. 그러나 이들 방법은 대부분 L-페닐알라닌 생산수율이 대단히 낮다.따라서, 본 기술의 목적은 최근 균주 개량에 많이 사용되는 유전자 재조합 기술을 이용하여 종래 이들 미생물보다 생산성이 우수한 균주를 개발하는 것이다.본 기술은 L-페닐알라닌 생합성에 중요한 유전자를 페닐알라닌 생합성 대사조절이 잘 해제된 변이주 MSEC 101-5주로부터 분리한 후, 다시 유전자 수용균주에서 안정적으로 재조합 유전형질을 발현시킬 수 있는 플라스미드에 삽입하여 형질전환시킴으로써 새로운 군주 MWPEC 12-45를 개발하였다.본 기술의 균주 MWPEC 12-45주의 생리적 성질을 조사한 결과 수용균주로 사용한 MWEC 101-5 주와 거의 동일하였으나, L-페닐알라닌 생산성을 현저히 증가하는 결과를 보였다본 기술에서 사용한 유전자 조작 방법은 다음과 같다.L-페닐알라닌의 생산은 대장균세포내에서 2개의효소반응에 의해서 엄밀한 제어를 받는 것으로 알려져 있다. 그 하나는 pheA유전자로 코드되는 코리스메이트 뮤타아제 P-프리페네이트 디하이드라타아제가 촉매하는 반응이고, 다른 하나는 argG유전자로 코드되는 3-디옥시-D-아라비노-햅툴로소네이트-7-포스페이트 신타아제가 촉매하는 반응이다.이 DAHP 신타아제는 3가지 동종효소로 구성되고 aroF 및 aroH 유전자로 코드된다. 본 기술은 L-페닐알라닌 생합성에 중요한 aroF-tyrA 및 pheA 유전자를 페닐알라닌 생합성 대사조절이 잘 해제된 변이주 MWEC 101-5주로부터 산탄식 방법으로 분리한 후 다시 본 기술에서 사용한 유전자 수용균주에서 안정적으로 재조합 유전형질을 발현시킬 수 있는 플라스미드에 삽입하여 형질전환시킴으로써 L-페닐알라닌의 생산성이 증가된 새로운 군주 MWPEC 12-45를 개발할 수 있었다.
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- 특허법인충정
- 등록일
- 2001-04-07
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일반기술
생명과학 > 미생물자원
본 기술은 L-페닐알라닌의 생합성에 관여하는 유전자가 재조합된 새로운 미생물에 의해서 통상의 배양방법으로 L-페닐알라닌을 제조하는 방법에 관한 것이다. L-페닐알라닌은 필수 아미노산의 일종으로 의약품 혹은 저칼로리 감미료인 아스파탐의 합성원료로 사용되는 물질이다.종래 L-페닐알라닌 제조방법으로는 브레비박테리움 혹은 코리네박테리움속 미생물의 타이로신 요구성 변이주에 의한 방법과 에쉐리시아 콜리의 타이로신 요구성에 트립토판 아날로그 내성 변이주에 의한 방법 등이 있다. 그러나 이들 방법은 대부분 L-페닐알라닌 생산수율이 대단히 낮다.따라서, 본 기술의 목적은 최근 균주 개량에 많이 사용되는 유전자 재조합 기술을 이용하여 종래 이들 미생물보다 생산성이 우수한 균주를 개발하는 것이다.본 기술은 숙주의 L-페닐알라닌 생산능력에 전혀 영향을 주지 않으면서 재조합 유전자의 발현을 배양 온도에 따라 조절 가능한 새로운 유전자 재조합균주 MWPEC 13-60을 제공하고 있다본 기술에서 사용한 유전자 조작 방법은 다음과 같다.L-페닐알라닌의 생산은 대장균세포내에서 2개의효소반응에 의해서 엄밀한 제어를 받는 것으로 알려져 있다. 그 하나는 pheA유전자로 코드되는 코리스메이트 뮤타아제 P-프리페네이트 디하이드라타아제가 촉매하는 반응이고, 다른 하나는 argG유전자로 코드되는 3-디옥시-D-아라비노-햅툴로소네이트-7-포스페이트 신타아제가 촉매하는 반응이다.이 DAHP 신타아제는 3가지 동종효소로 구성되고 aroF 및 aroH 유전자로 코드된다. 본 기술은 L-페닐알라닌 생합성에 중요한 aroF-tyrA 및 pheA 유전자를 페닐알라닌 생합성 대사조절이 잘 해제된 변이주 MWEC 101-5주로부터 산탄식 방법으로 분리하고, 유전자 발현을 최대로 증가시켜 주기 위하여 강력한 프로모터의 하나로 알려진 λ파아지의 PR-PL 프로모터와 연결시킨 후 이 프로모터의 발현을 조절하기 위하여 새로운 온도 감수성 억제체를 사용하였다.본 기술에서 사용된 억제체의 온도 감수성 범위는 31℃-34℃로 재조합된 유전자를 수용하는 에쉐리시아 콜리 MWEC 101-6주의 L-페닐알라닌 생산 최적온도인 31℃-32℃에 가장 적합하게 만들어진 것이다
- 보유기관
- 특허법인충정
- 등록일
- 2001-04-07
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일반기술
생명과학 > 미생물자원
본 기술은 에쉬리시아 콜리(Escherichia coli)의 돌연변이주중 L-페닐알라닌 생산균주를 탄소원, 질소원, 기타 유용한 유기 및 무기 영양원을 함유하는 배양배지에서 호기적인 배양을 하여 배지내에 고농도의 L-페닐알라닌을 생산, 축적시키는 발효법에 의해 L-페닐알라닌의 공업적 제조방법에 관한 것이다.본 기술은 종래 제조방법의 단점을 극복하고 저가의 생산원가로 대량생산을 위해서 보다 고수율의 생산능력을 갖춘 돌연변이체의 개발을 목적으로 하고 있다.본 기술에서의 균주 에쉬리시아 콜리 MWWJ304주는 MWEC101-6주를 모주로 하여 연속적인 변이처리를 행함으로써 고농도의 페닐알라닌 및 타이로신 아날로그 물질에 대한 내성 강화주이며 온도 감수성 타이로신 누수(leaky)주를 개발하고 이들 중 L-페닐알라닌 생산성이 우수한 균주를 선별하여서 얻을 수 있었으며, 이 새로운 균주를 이용하면, 저렴하게 L-페닐알라닌을 생산할 수 있게 된다L-페닐알라닌은 필수아미노산의 일종으로 의약품 원료, 혹은 저칼로리 감미료인 아스파탐의 합성원료로 사용되며, 일부식품의 첨가제로 사용되는 물질이다. L-페닐알라닌은 미생물의 생합성 경로가 복잡하고 방향족환을 갖는 구조식의 영향 등으로 생산수율은 일반적으로 대단히 낮으며, 생육이 불량하여 발효지연 등의 문제점이 있어왔다.본 기술에서 최종적으로 선별된 에쉬리시아 콜리 MWWJ304가 모주인 MWEC101-6주와 다른 생리학적 성질은, 온도변화에 따라 생육을 위해 L-타이로신의 보충을 요구하는 온도감수성 타이로신 누수주인 점, 자일로스, 리보스 등 5탄당 이용능이 저하된 균주인 점, L-페닐알라닌, L-타이로신 아날로그 물질들에 대한 완전내성을 가지고 있는 점으로 요약된다
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- 특허법인충정
- 등록일
- 2001-04-07
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일반기술
생명과학 > 미생물자원
본 기술은 유전자 재조합 기술에 의하여 L-페닐알라닌 생합성에 관여하는 유전자가 재조합된 플라스미드를 함유한 새로운 에쉬리시아 콜리(Escherichia coli)를 배양하여 L-페닐알라닌을 제조하는 방법에 관한 것이다.본 기술의 목적은 유전자 재조합 기술을 이용하여 세포안에서 생합성 관련 유전자들의 발현을 최적화하여 L-페닐알라닌의 생산성을 향상시킨 새로운 우수한 균주의 개발하는 것이다.본 기술은 유전자 재조합 기술에 의해 재조합된, 코리스메이트 뮤타아제 p-프리페네이트 디히드라타제를 코딩하는 pheA유전자, 3-데옥시-D-아리비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타아제를 코딩하는 aroF, 이들 두 유전자의 발현을 위한 두개의 프로모터 및 온도 감수성 리프레서 유전자를 함유하는 새로운 플라스미드 pMW16을 개발하여, 플라스미드 pMW16에 의해 형질전환된 재조합 세포를 배양함으로써 L-페닐알라닌을 고수율로 생산하는 방법을 제공하고 있다L-페닐알라닌은 필수 아미노산의 일종으로 주로 의약품 원료 및 저칼로리 감미료인 아스파탐의 원료로 사용되고, 일부 식품의 첨가제로도 사용되는 물질이다.종래 L-페닐알라닌 제조방법으로는 브레비박테리움 혹은 코리네박테리움 속 미생물의 타이로신 요구성 변이주에 의한 방법과 에쉐리시아콜리의 타이로신 요구성에 트립토판 아날로그 내성 변이주에 의한 방법 등이 있으나, 이들 방법은 대부분 L-페닐알라닌 생산수율이 비교적 낮은 결점이 있다.본 기술에서 사용한 유전자 조작 방법은 다음과 같다.본 기술에서는 L-페닐알라닌 생합성에 중요한 유전자인 aroF와 pheA의 발현을 최대로 증가시키기 위해 강력한 프로모터의 하나로 알려진 λ파아지의 PL프로모터를 각각의 유전자에 연결시킨 후 유전자 발현을 조절하기 위해 온도감수성 리프레서를 사용하였다.이 재조합 플라스미드 pMW16은 온도 감수성 타이로신 누수주인 에쉬리시아 콜리 MWWJ304에 형질전환하여 한천배지에 도말후 배양하여 생육한 균주중 DAHP 신타아제 활성이 증가되고, L-페닐알라닌 생산성이 우수한 균주 MWPWJ304를 선별하였다
- 보유기관
- 특허법인충정
- 등록일
- 2001-06-20
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일반기술
생명과학 > 기타 유전자 공학
효모 사카로마이세스 세레비시에에서 재조합 인간 혈장알부민을 효율적으로 생산하기 위한 고효율 알부민 발현벡터 조립 및 이를 함유한 형질전환체의 배양 방법에 관한 것이다. 본 기술에서는 인체에 대해 병원성이 없고 내독소를 생산하지 않는 GRAS 미생물이며 현재 여러 효모 시스템 중에서 숙주-벡터 시스템이 가장 잘 확립되어 있는 효모 사카로마이세스 세레비시에를 숙주로 하여 분비 발현율이 우수한 재조합 알부민 발현 벡터를 개발하고 이로써 알부민 단백질을 높은 발현율로 생산할 수 있는 배양조건을 확립하고자 하였다. 이에 본 기술은 효모 사카로마이세스 세레비시에에서의 알부민 발현 벡터들을 제조하는 과정과 상기 발현 벡터를 함유한 효모 형질전환체의 선별, 이로부터 재조합 인간 혈장 알부민의 발현을 극대화하고 동시에 분비된 HSA의 분해를 최소화하여 고농도로 축적된 재조합 인간 혈장 알부민을 생산하는 공정으로 구성된다. 본 기술에 따르면 조립된 HSA 발현벡터로 형질전환된 효모균주를 완충용액이 첨가된 배지에서 배양하면 고효율로 발현분비된 재조합 HSA 단백질을, 분해되지 않은 완전한 형태로 배지에 축적된 상태로 얻을 수 있어, 의약산업상 매우 유용한 기술이 될 것이다인간 혈장알부민(HSA)은 585 개의 아미노산으로 이루어진 분자량 66.6 kDa 크기의 단백질이다. 혈장 단백질 함량의 약 60%를 차지하는 알부민은 혈장의 삼투압을 유지하는 역할과 더불어 지방산, 담즙 색소, 아미노산, 스테로이드 호르몬, 금속 이온들을 운반하는 역할을 한다. 알부민은 혈장 확장액의 대체용액으로 또는 출혈시 혈액보충액으로 사용되고 있어 의료학적으로 그 수요량이 크게 증가하고 있다. 현재까지 인간 혈장알부민은 혈액으로부터 분리 정제한 것을 주로 사용하고 있으나, 병원균이나 바이러스의 오염에 의한 안정성 문제가 최근 크게 대두되고 있어서 재조합 알부민의 대량생산이 절실히 필요하게 되었다. 본 기술은 효모 사카로마이세스 세레비시에 유래의 프로모터와 알부민 자체 또는 효모 유래의 분비 시그날을 포함한 알부민 cDNA를 포함한 알부민 발현벡터의 조립, 이를 함유한 형질 전환 효모의 선별, 완충액 또는 질소원의 첨가로 인해 배지 pH를 5-6으로 유지함으로써 형질전환체에서 발현분비된 알부민의 분해를 최소화시켜 인간 혈장알부민을 고효율로 배양 생산하는 방법으로써, 본 기술에 의해 재조합 알부민의 대량생산이 가능해 진
- 보유기관
- 특허법인충정
- 등록일
- 2001-05-18
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일반기술
생명과학 > 기타 유전자 공학
효모 한세눌라 폴리모르파에서 재조합 인간 혈청 알부민을 효율적으로 대량 생산하기 위한, 고효율 알부민 발현벡터 조립 및 이를 함유한 형질전환체의 제조 및 배양방법에 관한 것이다.본 기술에서는 메탄올 자화효모로서 높은 생산성 및 고농도 배양의 장점으로 인해 새로운 재조합 단백질 발현 시스템으로 각광을 받고 있는 효모 한세눌라 폴리모르파를 숙주로 하여 분비 발현율이 우수한 재조합 알부민 발현 벡터를 개발하고, 이 벡터들이 도입된 형질전환주의 선별 및 고효율 발현주의 선별을 통해 인간 혈청알부민을 제조하는 방법을 제공하자 하였다..따라서 본 기술은 메탄올 자화효모 한세눌라 폴리모르파를 숙주세포로 하여 인간 혈청 알부민을 발현시키는 데 적합한 발현벡터들을 조립하는 과정과 상기 발현벡터를 함유한 효모 형질전환체 선별, 이로부터 고효율 발현주를 선별하는 과정 및 고효율 발현주로부터 인간 혈청 알부민을 제조하는 방법으로 구성된다. 본 기술에 따르면 조립된 HSA 발현벡터로 형질전환시킨 고효율 생산 변이주에서 선별된 재조합 한세눌라 폴리모르파 변이주를 메탄올이 함유된 배지에서 배양시켜, 발현분비된 재조합 인간 혈청알부민을 대량으로 생산할 수 있으므로, 알부민의 수요가 급증하고 있는 의약산업상 매우 유용한 기술이 될 것이다인간 혈청알부민 (HSA)은 585개의 아미노산으로 이루어진 분자량 66.6 kDa 크기의 단백질이다. 혈장 단백질 함량의 약 60%를 차지하는 알부민은 혈장의 삼투압을 유지하는 역할과 더불어 지방산, 담즙 색소, 아미노산, 스테로이드 호르몬, 금속 이온들을 운반하는 역할을 한다. 알부민은 혈장확장액의 대체용액으로 또는 출혈시 혈액보충액으로 사용되고 있어 의료학적으로 그 수요량이 크게 증가하고 있다. 현재까지 인간 혈청알부민은 혈액으로부터 분리 정제한 것을 주로 사용하고 있으나, 병원균이나 바이러스의 오염에 의한 안정성 문제가 최근 크게 대두되고 있어서 재조합 알부민의 대량생산이 절실히 필요하게 되었다. 재조합 단백질 생산시 숙주 세포로서 효모 사카로마이세스 세레비시에가 갖는 단점들의 보완을 위하여 최근에 여러 효모 시스템이 대체숙주로서 개발되었다. 이들 중 효모 한세눌라 폴리모르파는 값 싼 원료물질인 메탄올을 에너지원과 탄소원으로 이용할 수 있어 경제성이 높고, 메탄올 대사에 관련되는 메탄올 옥시다제(MOX) 또는 알코올 옥시다제(AOX) 유전자의 프로모터와 같이 비교적 조절이 용이하면서도 매우 강력한 프로모터를 갖고 있어 산업적 응용 측면에서 응용성이 매우 높다. 또한 고농도 배양이 용이하고 형질 전환시 발현 목표유전자가 숙주의 염색체상으로 다수 도입되어 비선택 배지에서 도입된 발현벡터의 안정성이 뛰어난 장점이 있다. 본 기술은 효모 한세눌라 폴리모르파 DL-1 유래의 MOX 프로모터와 알부민 자체의 분비 시그날을 포함하는 알부민 cDNA를 이용하여 발현벡터를 조립하고, 이를 효모 한세눌라 폴리모르파에 도입하여 조립된 발현벡터가 염색체에 삽입된 형질 전환 효모를 선별, 발효 배양시켜 인간 혈청알부민을 고효율로 발현시켜 인간 혈청알부민을 대량 생산할 수 있는 방법이다
- 보유기관
- 특허법인충정
- 등록일
- 2001-05-18
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일반기술
생명과학 > 기타 생물공정·대사공학
유기용매 내성을 가지는 에스테라제를 생성하는 슈도모나스속 신균주인 스튜트제리에 관한 것으로, 본 기술의 목적은 유기용매에 내성이 있는 균주만을 분리함으로써 유기용매의 존재하에서도 내성을 나타내며 에스테르결합을 가수분해하여 생리활성물질의 광학합성에 주요한 수단으로 이용되는 에스테라제를 생산할 수 있는 슈도모나스속 신균주를 제공하는 것이다.본 기술은 LB 배지에 유기용매인 사이클로헥산을 첨가한 균분리용 배지에 폐수, 세차장 퇴적토, 주유소 토양, 차량정비소 토양 등을 균 분리시료로 첨가하여 진탕배양 할 때, 5%, 25%로 유기용매 농도를 점진적으로 증가시킨 배지에 이동시키면서 균의 생육여부를 확인하여 유기용매 내성균인 슈도모나스 스튜트제리 CH-120을 분리해내고, 이 내성균에 의해 생산된 에스테라제의 유기용매에 대한 안정성을 조사함으로써, 유기용매 내성 에스테라즈를 생성하는 슈도모나스속 신균주를 분리 동정하는 방법이다.본 기술에 의하면 상기 신균주 슈도모나스 스튜트제리 CH-120이 생산하는 에스테라제는 다양한 유기용매에 대해 대부분 활성을 잃지 않고 안정된 효과를 나타낸다에스테라제(Esterase)란 에스테르결합을 가수분해하는 효소의 총칭으로서, 에스테라제는 에스테르 결합의 분해나 합성 반응시, 테트라하이드로이소퀴놀라인, 아자바이사이클로노난, 인돌마이신과 같은 생리활성물질의 광학합성에 유용하게 이용될 수 있다. 그러나, 특정의 아세톤, 알콜류 등의 유기용매가 효소반응의 매체로 사용되는 경우에는, 효소반응에 적용된 효소와 유기용매사이의 단백질 변성반응에 의해 에스테라제는 쉽게 실활되며 미생물 자체에도 아주 강한 독성을 나타내는 문제가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 효소의 고정화 또는 단백질공학 수법을 이용하여 유기용매계에서 효소를 안정화시킬 수 있는 개선방법이 있으나, 고정화의 비용, 안정성의 상실, 단백질공학 수법의 난이성 등의 문제점이 있다.본 기술에서는 유기용매에 내성을 나타내는 에스테라제를 생성하는 신규주 슈도모나스 스튜트제리 CH-120을 분리 동정하였는데, 이 균주의 시간별 에스테라제 역가를 측정한 결과 사이클로헥산이 첨가된 배지에서 첨가하지 않은 경우에 비하여 활성이 50% 정도 증가되었고, 특히 균체 대비활성에 있어서는 사이클로헥산을 첨가한 경우 약 3배 정도 증가하는 것으로 나타났다. 또 본 기술의 에스테라제는 아세톤과 에탄올에서도 역가의 감소가 관찰되지 않았으며, 유기용매에 대한 효소안정성이 가장 낮은 것으로 나타난 클로로포름에서도 유기용매를 첨가하지 않은 대조군과 대비하여 55%의 역가를 유지하는 것으로 나타나 유기용매에 대해 매우 안정한 효소임을 알 수 있다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-18
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일반기술
생명과학 > 기타 생물공정·대사공학
주반응으로 UDP-xylose를 합성하며, 부반응으로서 TDP-glucose, UDP-glucose, UDP-mannose, UDP-N-acetylglucosamine, UDP-galactose 등 다양한 당핵산염을 합성하는 신규한 UDP-xylose pyrophosphorylase(UXPase)에 관한 것이다. 본 기술의 목적은 신규한 UXPase 효소의 유전자 염기서열을 결정하고, 이 유전자를 포함하는 발현벡터 및 그에 의해 형질전환된 대장균을 배양하여 신규한 내열성 재조합 UXPase 효소를 용이하게 대량생산하는 방법을 제공하는 것이다.본 기술은 고온성 박테리아인 Thermus caldophilus GK24로부터 당핵산염 복합효소를 분리정제하고, 이로부터 제한효소 절단, cosmid library 제조, transformation, southern hybridization 및 subcloning을 통하여 UXPase 유전자를 클로닝한 다음, pGLB와 UXPase를 발현시키기 위한 프라이머 유전자를 사용하여 PCR을 수행한 후, 발현벡터에 삽입하고 대장균에 도입하여 UXPase 발현시켜 정제하고, 정제된 UXPase의 기질특이성과 염 및 온도에 따른 재조합 UXPase의 활성을 측정하는 기술이다당핵산염 합성효소는 삼인산염(NTP)과 hexose 1-P로부터 NDP-hexose를 합성하고 pyrophosphate를 방출하는 가역반응을 촉매한다. 핵산염 합성효소에 의해서 합성된 당핵산염(NDP-hexose)은 효소를 이용하여 연속적으로 glycosyltransferasereaction의 기질로서 사용될 수 있다. 효소를 이용하여 생물학적 활성이 있는 각종 복합 탄수화물 및 탄수화물 유도체를 합성하기 위해서는 전구체인 NDP-hexose를 합성하는 효소가 필요하며, 특히 효소의 정제를 쉽게 하기 위하여 고온에서 안정한 내열성 효소가 필수적이다. 이에 본 기술에서는 주반응으로 UDP-xylose를 합성하고 부반응으로 다양한 당핵산염을 합성할 수 있는 신규한 내열성 UXPase 효소를 제공한다. 본 기술에서의 UXPase의 분자량은 160kDa 이었는데, 아미노산 서열로부터 계산된 분자량(38kDa)과 비교하였을 때 tetramer로서 작용함을 알 수 있다. 또 UXPase의 기질특이성을 조사한 결과 UTP와 xylose 1-phosphate외에 다양한 기질에 기질특이성을 나타냈다.한편, 본 기술의 UXPase는 2가 양이온을 cofactor로서 필요로 한다. UXPase를 Mg2+, Co2+, Ni2+, Mn2+의 존재하에 활성을 측정한 결과, 특히, Mn2+을 사용했을 때에는 Mg2+보다 높은 활성을 나타냈다(Mn2+ ＞ Mg2+ ＞ Ni2+ ＞ Co2+). 또한, UXPase는 80℃에서 1시간동안 100%의 활성을 유지하여 열에 매우 안정함을 알 수 있다. 그러나 90℃ 이상의 온도에서는 불안정하여, 95℃에서 15분의 half-life를 나타냈다. 본 기술에 의하면 상기 신규한 재조합 UXPase를 대량생산할 수 있으므로, 탄수화물 공학에서 기능적 생당체 합성 등 여러 당핵산염을 필요로 하는 생물공학 산업상 매우 유용한 기술인 것이다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-18
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일반기술
생명과학 > 식물자원
슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD; superoxide dismutase)와 아스코르베이트 퍼옥시다제(APX; ascorbate peroxidase)를 이용한 환경스트레스 내성식물의 개발에 관한 것이다. 본 기술의 목적은 식물체에 환경스트레스에 대한 저항성을 부여하기 위해 SOD 및 APX를 엽록체에 동시 발현시킨 식물체를 개발하고자 하는 것이다. 본 기술은 완두에서 분리한 SOD의 cDNA와 APX의 cDNA를 조작하여, 카나마이신에 저항성을 갖고 있는 담배에 SOD를 형질전환시키고 이어서 상기 형질전환 담배에 바스타를 선별표지로 하여 APX를 재도입하거나, 반대로 카나마이신에 대한 저항성을 가진 담배에 APX를 먼저 형질전환시킨 뒤 바스타를 선별표지로 사용하여 SOD를 재도입하여 이중으로 형질전환시킴으로써, 환경스트레스에 대한 저항성 담배를 제조하는 방법이다. 본 기술에 의하면 SOD와 APX를 동시에 엽록체에서 발현시킴으로써 환경 스트레스에 보다 저항성을 갖는 식물체를 개발할 수 있다. 따라서 이러한 SOD 및 APX를 엽록체에서 동시에 발현시키는 방법은 점차 악화되고 있는 환경에서 생산성을 유지할 수 있는 식물체의 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다SOD와 APX는 활성 산소종의 제거와 수산화 라디칼의 예방에 관여하는 항산화 효소이다. SOD는 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼을 과산화수소(H2O2)로 전환시키는 효소이고, APX는 아스코르베이트를 전자공여체로 사용하여 H2O2를 물로 전환시키는 효소이다. 한편, 식물체의 엽록체에서는 비교적 높은 농도의 산소가 상존하며, 빛에너지를 이용하여 물을 분해하는 과정에서 발생되는 전자의 에너지를 활용하기 위한 전자전달계가 존재하고 있어 다양한 산화적 스트레스에 민감하게 반응한다. 따라서 엽록체의 항산화능력을 높일 수 있다면 환경스트레스 조건에서도 식물의 생산성을 유지시킬 수 있을 것으로 기대된다. 이에 본 기술에서는 식물체에 SOD와 APX를 동시에 발현시켜 항산화능력을 높여줌으로써 산화적 스트레스에 저항성을 갖도록 하는 방법을 제공한다. 본 기술에서는 SOD와 APX를 완두에서 얻었으며, 형질전환의 대상이 되는 식물체는 담배로 결정하였다. 본 기술의 이중형질전환 식물체는 산화적인 스트레스를 야기하는 파라킷(paraquat)을 처리하는 경우, SOD 및 APX가 이중발현하는 식물체의 잎의 가시적인 손상이 비형질전환 식물체의 손상보다 매우 적게 나타나 본 기술에 의한 이중 형질전환 식물체가 산화적 스트레스에 보다 저항성이 있는 것을 알 수 있었으며, 더욱이 중금속인 카드늄에도 내성을 나타내어 엽록체에 과발현된 SOD와 APX는 중금속에 의해 유도되는 산화적 스트레스를 경감시키는 효과가 있었다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-18
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일반기술
생명과학 > 기타 생물공정·대사공학
라넬라 아쿠아틸리스 유래의 레반수크라제를 이용하여 설탕과 알콜로부터 알킬베타-디-프럭토시드를 생산하는 방법으로서, 높은 알콜농도를 유지하는 수용액상에 레반수크라제를 도입하여 가수분해 반응을 억제함으로써 알킬베타-디-프럭토시드의 생산수율을 향상시키는 것이며, 아울러 수용액상의 알콜 종류를 다양화하여 여러 종류의 알킬베타-디-프럭토시드를 생산하는 방법을 제공한다. 상술하면 일정량의 설탕을 용해한 메스(4-모폴린에탄설포닉산) 완충용액에 라넬라 아쿠아틸리스(Rahnella aquatilis)로부터 유래된 레반수크라제와 여러 알콜을 첨가하여 알킬베타-디-프럭토시드의 양을 측정하고, 알콜농도를 높인 후 저온에서 반응을 실시하여 얻은 알킬베타-디-프럭토시드의 양을 측정,비교하여 생산수율을 향상시키는 방법이다.본 기술에 따르면 메탄올, 에탄올, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등과 같은 여러 가지 알콜을 사용하여 알킬베타-디-프럭토시드를 제조할 수 있으며 , 알콜농도는 높이고 반응 온도는 저온으로 유지하여 베타-디-프럭토시드를 고수율로 생산할 수 있다베타-디-프럭토시드는 알킬글루코시드의 대체제로 사용이 가능한데, 알킬 글루코시드는 의약품, 식품, 화장품 등에 사용되고 있는 당 계면활성제의 일종인 알킬 글루코시드 지방산에스테르의 원료물질로 이용되고 있다. 특히 글루코오스에 비해 프럭토오스는 녹는점이 낮고, 수분 및 유기용매에 대한 용해도가 높기 때문에 알킬 프럭토시드 또한 알킬 글루코시드에 비해 기능성이 높을 것으로 예상되고 있다. 한편, 레반수크라제는 수용액상에서 설탕을 기질로 사용하여 높은 분자량의 수용성 프럭토오스 고분자 물질을 합성하는 효소이다. 본 기술에서는 레반수크라제에 의한 프럭토오스 유도체중 알킬베타-디-프럭토시드의 수율을 높이기 위해서, 반응온도를 낮추어 효소의 안정성을 크게 증가시킴으로써 고농도의 알콜에서도 효소활성이 유지되도록 하였다. 다양한 알콜을 사용하여 그 반응성을 조사한 결과, 히드록실기가 2개 이상인 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세롤이 메탄올이나 에탄올에 비해 반응성이 훨씬 좋은 것으로 나타났으며, 또한 메틸 베타-디-프럭토시드의 생성수율을 높이기 위하여 메탄올의 농도를 높여 반응한 실험결과 반응속도는 저하되었으나 수율은 크게 증가하는 양상을 보였다.다양한 알콜을 고농도로 포함하는 수용액에 설탕을 첨가하고 레반수크라제와 저온에서 반응시킴으로써, 알킬베타-디-프럭토시드를 고수율로 생산할 수 있으므로 식품, 의약품 및 화장품 산업상 대단히 유용한 기술이다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-17
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일반기술
생명과학 > 미생물자원
토양으로부터 분리된 곰팡이 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) FM-F-93에 의해 생산된 항암물질 GERI-BP002A로서, 미생물을 배양,여과하여 수득된 균체를 아세톤 및 에틸 아세테이트로 차례로 추출하여, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC를 이용하여 GERI-BP002A를 정제한 다음, 인간 암세포주들을 이용하여 그 항암활성을 확인한 결과 강력한 항암효과를 가지는 것으로 나타났다암의 발생률은 문명이 발달함에 따라 증가하고 있음에도 불구하고 암 발생의 근본원인을 지적할 수 있을 정도로 암의 원인이 규명되어 있지는 않다. 암환자의 치료법에는 외과적 수술, 방사선 치료, 항암물질 투여에 의한 화학요법 등이 있지만 대부분 조기 암환자나 특정 암에만 국한되어 암으로 인한 사망은 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 이에 토양에서 분리된 아스퍼질러스속 곰팡이가 생산하는 물질 GERI-BP002A가 항암 활성을 나타냄을 발견하여 신규 항암제로서의 용도를 제공한다. GERI-BP002A의 생체 독성시험에서 ICR 생쥐에 복강내 주사하였을 때, LD는 500mg/kg 체중으로 나타났으며, 한편 GERI-BP002A의 항암활성을 인간 암세포주들인 A549(human non-small cell lung), SKOV-3(human ovarian), HCT-15(human colon), XF-498(human CNS), SKMEL-2(human melanoma)를 이용하여 측정한 결과, 강력한 항암효과를 확인하였다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-17
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일반기술
생명과학 > 기타 생명과학
극히 빠른 속도로 DNA 염기서열을 결정하는 장치로서, 자동화 판 겔 전기영동 시스템보다 더 신속하게 DNA 염기서열을 결정한다. 본 분석장치는 모세관으로 전개한 시료에 광을 조사하여 시료를 분석함에 있어, 시료에 조사되기 위한 서로 다른 파장의 광을 제공하기 위한 광원수단과, 시료가 광에 의해 스캔되도록 모세관을 이동시키는 수단, 광을 시료에 조사하여 발생한 빛을 집속하기 위한 수단과 상기 집속된 빛에서 시료와 상호작용하는 파장을 선택하기 위한 수단 및 상기 선택된 파장의 광을 검출하기 위한 수단을 포함하여 구성된다. 본 기술에 의한 분리후 스캔-검출 장치는 모세관으로 전개된 시료를 신속히 검출하여 매우 빠르게 시료를 분석할 수 있으며 특히 DNA염기서열을 결정하는데 유용하게 사용될 수 있다. 더욱이, 여러 가지 시료를 분석해야 하는 경우에 전체 분석시간을 단축시킬 수 있으며, 광원으로 레이저를 사용하는 경우에 값비싼 레이저의 실제 사용시간을 줄일 수 있다DNA 염기서열 결정은 생명과학에서 매우 중요한 연구 수단이다. 현재 일반적으로 사용되고 있는 방법은 동위원소가 치환된 염기서열 결정반응 생성물의 폴리아크릴마이드 겔 전기영동으로 분자량에 따라 분리하고 방사선 자동사진법으로 각 성분을 검출하여 DNA 염기서열을 결정하는 것이다. 최근에는 분리 속도가 빠른 모세관 때문에 겔 전기영동(CGE)을 DNA 염기서열 결정에 이용하려는 연구가 많이 수행되고 있다. CGE는 판 겔 전기영동보다 개별적인 분리속도가 월등히 빨라 DNA 염기서열 결정법에 유용한 분리 방법이지만, 일반적인 CGE에서는 염기서열 결정반응 생성물을 하나의 모세관을 사용하여 전개, 분리하면서 검출하기 때문에 여러 개의 시료를 동시에 분리, 검출할 수 없다는 단점이 있다. 본 기술에서는 CGE의 빠른 분리속도가 갖는 이점을 충분히 실리기 위하여, DNA 시료를 CGE로 일단 분리한 다음 모세관을 레이저로 스캔(scan)하여 DNA 염기서열을 결정하는 방법을 개발하였다. 스캔에 소요되는 시간은 수 분 정도로써 CGE에 걸리는 시간보다 훨씬 짧으므로, 여러 개의 시료를 여러 개의 모세관으로 동시에 CGE 시킨 뒤 모세관 하나씩을 레이저로 스캔하면서 이때 발생하는 레이저 유발형광을 검출하여 DNA 염기서열을 결정하면, 전체적인 염기서열 결정속도가 몇십배 빨라진다.즉, 모세관 겔 전기영동 전개와 검출과정을 따로 분리함으로써, 단위시간에 분석할 수 있는 시료의 수가 현저히 증가될 수 있다. 또한, DNA 염기서열결정법외에도 모세관 크로마토그래피 등에 본 기술의 장치를 이용하여 모세관으로 전개한 시료에 상호작용하는 적합한 파장의 광원을 선택함으로써 시료를 분석할 수도 있다.
- 보유기관
- 포항공과대학교
- 등록일
- 2001-05-16
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일반기술
생명과학 > 효소공학 (H73)
소의 췌장 유래의 프리프로카프복시펩티다제 A (preproCPA) 유전자를 포함한 재조합 발현벡터 및 형질전환된 곤충세포 Sf9 를 이용하여 카르복시펩티다제 A를 제조하는 방법이다. 소의 췌장으로부터 르 휴로우(Le Huerou) 등이 결정한 preproCPA의 뉴클레오티드 서열과는 다른 신규한 preproCPA 유전자를 발견하고, 이를 클로닝하여 그 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 이 신규한 preproCPA 유전자를 함유한 재조합 발현벡터로 형질전환된 곤충세포 Sf9를 제조하여 이로부터 발현된 proCPA에 트립신을 처리하여 활성 CPA를 다량으로 제공하는 방법이다.소의 카르복시펩티다제 A(CPA)는 한 개의 아연 이온을 포함하는 메탈로엑소펩티다제로서, 소수성 말단 잔기 즉, 방향족 혹은 곁사슬의 지방족 그룹을 가지는 폴리펩타이드의 C-말단아미노산을 우선적으로 가수분해하는 효소이다. CPA는 구조와 기능과의 연관성 측면에서 잘 연구된 효소중의 하나로 알려져 있다. 한편, 소의 CPA는 두 가지의 알로형으로 췌장에 거의 같은 비율로 존재하고 있으며, 한 형태는 아미노산 서열 179, 228 및 305번 위치에 이소루이신, 알라닌 및 발린을 가지며, 다른 한 형태는 같은 위치에 발린, 글루탐산 및 루이신을 가지는 것으로 밝혀졌다. 전기 아미노산의 차이로 인하여 크로마토그래피에 의한 분리 양상 및 열에 대한 안정성이 다른 것으로 추측된다. 본 기술에서는 소의 췌장조직으로부터 mRNA를 분리하고 역전사효소를 이용한 중합효소 연쇄 반응으로 preproCPA 유전자를 증폭하고, 증폭된 DNA 단편을 pBluescript SK(-)의 SmaI 부위로 삽입하여 재조합 플라스미드를 제조하였다. 또, 신규한 preproCPA 유전자의 뉴클레오티드 서열을 EooRI 제한효소로 절단하여 preproCPA 유전자를 분리하고 이를 BamHI 및 EooRI 제한효소로 절단된 배큘로바이러스 전이백터 pVL1393에 삽입하여 재조합 발현벡터 Pvl1393/ppCPA를 제조한 다음, 이 재조합 바이러스로 곤충세포 Sf9을 감염시키고 배양하여 수득한 세포배양액에 발현된 proCPA가 존재함을 웨스턴 블럿 분석으로 확인하였다. 제조된 CPA는 이를 단백질 분해에 사용하거나 또는 효소 반응을 조절하여 특이한 기질로부터의 펩타이드합성에 이용할 수 있다
- 보유기관
- 포항공과대학교
- 등록일
- 2001-05-16
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일반기술
생명과학 > 식물자원
한국형 페퍼 마일드 모틀 바이러스(PMMV; pepper mild mottle virus)의 게놈 RNA로부터 클로닝된 54-kDa 복제효소 유전자 및 이를 포함하는 발현 벡터로서 고추에 심각한 폐해를 끼치는 것으로 알려진 담배모자이크바이러스-p(TMV-p)의 54-kDa 복제효소 유전자를 클로닝하여 이를 식물에 도입함으로써 바이러스 저항성을 가지는 고추 또는 다른 작물을 개발하여 한국형 PMMV에 저항성을 가지는 작물, 특히 저항성 고추를 개발하는데 사용할 수 있는 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자와, 이 유전자를 이용하여 식물세포를 형질전환시키는데 사용되는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 유전 정보가 아직 알려져 있지 않은 TMV-p로부터 전체 게놈(genome) RNA를 분리하여, 랜덤 헥사머 및 역전사효소를 이용하여 cDNA을 합성하고 염기서열을 확인한 다음, 형질전환된 아그로박테리움을 사용하여 아그로박테리움 매개 형질전환 방법에 따라 식물세포를 형질전환시킨 후 조직배양 방법으로 배양하여 완전한 식물체로 성장시키는 방법이다. 본 기술에 의해 작물을 형질전환시켜 식물세포내에 복제효소 유전자 일부를 발현하는 작물을 제조함으로써 항바이러스성 고추 등의 신품종을 획득할 수 있다현재 다양한 작물의 재배 및 생산에 있어서 가장 큰 감수요인의 하나는 바이러스 병해로서 그 피해는 매우 심각하여 국내의 연간 피해액이 수백억원에 이르는 실정이다. 여러 작물들중에서도 특히 고추는 한국의 주요 작물중의 하나로서 바이러스의 감염으로 인해 큰 피해를 입고 있다. 고추의 주된 바이러스 병징은 모자이크와 주름증세로서, 특히 성장기에 가장 심하게 발병을 일으키는 바이러스는 담배 모자이크 바이러스(TMV)인데, 그 발병률은 전체의 89.1%에 달한다. 이외에도 국내에서는 알려지지 않았으나 외국의 경우 페퍼 마일드 모틀 바이러스 등도 심각한 피해를 끼치는 것으로 알려졌다. 이러한 고추의 바이러스성 질병을 타개하기 위해 야생종으로부터 바이러스 저항성 인자를 도입하기 위한 육종이 시도되고 있으나 기존의 품질을 유지하는 바이러스 저항성 고추 품종의 개발은 아직 미비한 상태에 있다.본 기술은 고추에 심각한 폐해를 끼치는 것으로 알려진 TMV-p의 54-kDa 복제효소 유전자를 클로닝하여 TMV-p의 54-kDa 복제효소 유전자의 염기서열을 결정한 결과 TMV-p가 PMMV와 동일함을 밝혀내었고, 이를 이용해 한국형 PMMV에 저항성을 가지는 작물을 개발하는데 사용할 수 있는 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자 및 이 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.이와 같이 유용한 유전자들을 분리하고 이들을 이용하여 효과적으로 작물의 바이러스병을 방제하는 것은, 신품종 개발을 통해 농가소득의 증대에 기여할 수 있다
- 보유기관
- 포항공과대학교
- 등록일
- 2001-05-15
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일반기술
생명과학 > 기타 유전자 공학
129/sv종 생쥐의 포배아로부터 유래된 새로운 배아 간세포주인 H3 배아 간세포주 및 이를 이용하여 유전자이식 생쥐를 제조하는 방법으로서, H3 배아 간세포주는 교미후 3.5일된 129/sv종 생쥐 암컷의 자궁을 절취하여 이로부터 포배아를 회수하여 배양하여 확보한다. 즉, 호르몬으로 인공배란을 유도한 FVB/N 종 암컷으로부터 포배아를 수거하고, 이어서 H3 배아 간세포를 각 포배아의 배강내에 주입하며, 이렇게 처리된 포배아는 다시 교미후 2.5일된 가임신된 숙주 생쥐의 자궁내에 재이식하여 키메라 생쥐를 제조한다.따라서, 보다 우수한 혈통의 포배아에서 우수한 생식세포 분화 능력을 갖는 새로운 배아 간세포를 얻고, 이를 이용하여 보다 우수한 혈통의 유전자이식 생쥐를 제조할 수 있다.배아간세포는 생쥐의 포배아로부터 유래된 세포주로서, 정상적인 염색체 구성을 가지며 생쥐 발생과정 중의 모든 종류의 세포 형태로 분화할 수 있는 잠재 능력, 즉 전분화능(totipotency)을 갖는다는 특성 때문에 포유류 유전학 연구에 있어 중요한 의미를 지닌다. 새로운 배아 간세포주 H3는 간세포 형태를 나타내며 10회 이상의 계대배양에서도 핵형이 일정하게 유지된다. 또한, 기존의 배아간세포는 키메라 제조시 주로 C57BL/6J 혈통의 포배아내에서만 생식세포 분화가 효과적이라고 보고된 반면, 본 기술의 H3 배아간세포는 FVB/N 혈통의 포배 배아와 섞어주어도 우수한 생식세포 분화능력을 나타낸다는 특징이 있다.FVB/N 혈통은 C57BL/6J 혈통에 비해 번식 및 새끼관리 능력이 뛰어나 실험 재료의 손실을 줄일 수 있으며, 인공배란 유도가 C57BL/6J 혈통보다 기술적으로 용이하므로 마리당 4-5배 더 많은 포배아를 얻을 수 있을 뿐 아니라, 이렇게 인공적으로 얻어진 포배아는 배아간세포 숙주로서 질적으로도 우수하다. 게다가 FVB/N 혈통은 백변종으로 배아간세포의 털색 표현형인 쥐색과 쉽게 대비되기 때문에, 출산 직후 안구 색소의 유무로써 키메라 생쥐를 선별할 수 있다는 장점도 있다. 또한, H3 배아 간세포주는 키메라 제조에 있어 보다 우수한 혈통의 숙주 포배아내에서 생식세포 분화 능력이 뛰어나 유전자이식 기술에 유용하게 이용될 수 있으며, 종래의 방법에 비해 물자, 노력, 시간, 비용 등을 절감시킬 수 있어 기술적 경쟁력을 확보할 수 있다.
- 보유기관
- 포항공과대학교
- 등록일
- 2001-05-11
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일반기술
생명과학 > 기타 생명과학
세포내 신호전달체계에 관여하는 포스포리파아제 C 감마 1(PLC-γ1) 동위효소와 결합하는 단백질 상호간의 결합효율을 엘라이자(ELISA)를 통해 정량적으로 분석할 수 있는 방법에 관한 것으로, 신호 전달과정에서 PLC-γ1과 결합하는 단백질 상호간의 결합 효소 및 이러한 결합에 의해 유발되는 세포내 또는 생체내의 비정상적인 현상, 특히 악성 종양의 발생 등에서의 중요성을 확인하기 위하여, PLC-γ1 동위효소의 SH 영역들을 가지고 효모 하이브리드시스템을 이용하여 두 단백질 상호간의 결합효율을 정량적으로 분석할 수 있는 변형된 ELISA 방법을 제공한다. 즉, PLC-γ1 동위효소로 ELISA 반응 플레이트를 코팅한 후, 글루타티온S 전이효소 결합 형태의 단백질을 상기 코팅된 플레이트에 결합시키고, 항 글루타티온 S 전이효소 항체를 반응시키고, 퍼옥시다제가 결합된 2차 항체를 반응시키고, 효소에 대한 기질을 주입하여 반응시키는 단계로 구성된, PLC-γ1 동위효소와 단백질 상호간 결합효율의 정량적 분석방법이다. 본 기술에 의하면 두 단백질 상호간의 결합정도를 단백질이 변성되지 않은 상태에서 정량적으로 분석할 수 있으며, 적절한 항체만 있으면 간단하고 편리할 뿐 아니라 경제적으로 이용할 수 있다. 또한, 이를 토대로 PLC-γ1 동위효소와 관련된 신호전달체계를 차단할 수 있는 물질을 개발, 확인하여 궁극적으로는 PLC-γ가 관련된 암환자에서 화학적 치료제의 개발에 기여할 수 있을 것으로 기대된다포스포이노시티드에 특이적인 포스포리파아제 C(PLC) 동위효소들은 여러 성장인자들과 세포분열 촉진인자들에 대한 몇몇 초기 세포반응의 하나로서 활성화된다. 그중 PLC-γ는 수용체 티로신 키나아제와 세포내에 있는 티로신 키나아제에 의해 활성화되는데, PLC-γ를 과발현시킨 NIH3T3 세포를 누드 마우스에 이식시켰을 때 종양이 발생하는 것이 관찰되었고, 암조직중 유방암과 결장암에서 PLC-γ가 과발현 되어 있음이 알려졌다. 이러한 PLC-γ1 동위효소와 관련된 신호전달체계 연구와 이 동위효소의 활성을 저해하는 물질의 개발을 위해서는 PLC-γ1 동위효소와 다른 단백질간의 결합 역가를 분석할 필요가 있어서, 본 기술을 개발하게 되었다. 본 기술은 동시면역 침전 반응에서 볼 수 있는 세포내에서의 단백질 상호작용에 대한 정성적인 분석을 넘어서 시험관 내에서의 정량적인 분석이 가능하여, 생체내 또는 세포내 조건에서 하기 어려운 실험들에 대한 대체실험으로도 이용할 수 있다. 즉, 두 단백질간의 상호작용을 촉진 또는 저해시키는 물질을 많은 시료들로부터 탐색하는데 유리하게 이용할 수 있다. 특히 본 기술의 글루타티온 S 전이효소가 결합된 형태의 단백질들을 이용한 분석방법에 있어서는 글루타티온 S 전이효소에 대한 항체를 이용함으로써 원하는 단백질들의 상호작용이 항체에 의해 방해받는 것을 피할 수 있다는 장점도 있다
- 보유기관
- 포항공과대학교
- 등록일
- 2001-05-16
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