일반기술
보건·의료 > 의약품 제제 개발 기술
스타필로코커스속 균주가 생산하는 혈전용해능을 가지는 새로운 스타필로키나제로서, 스타필로코커스속 균주로부터 혈전용해능이 우수한 오레우스 균주를 선별하고, 이로부터 스타필로키나제를 확인하여 그의 유전자를 분리하고 그 염기 서열 및 아미노산 서열을 결정함으로써 기존의 혈전용해제의 단점을 극복한 새로운 혈전용해성 단백질을 제공한다. 스타필로코커스속 균주를 피브린 플레이트 분석방법 등으로 조사하여 스타필로코커스 오레우스 ATCC 29213 균주가 혈전을 용해하는 기능이 우수함을 확인한 다음, 배양 상등액으로부터 새로운 혈전용해 활성을 가지는 15 kDa의 스타필로키나제를 얻은 후, 그 아미노산서열과 유전자 및 DNA 염기서열을 분석하였다.플라즈미노겐 활성인자를 정맥주사하여 혈전용해계를 활성화하는 치료법이 지난 30여년간 보편적으로 사용되어 왔는데, 혈전에 대한 특이성이 없으므로 치료기간 동안에 전신출혈 등의 부작용이 보고되었다. 최근 자연계의 여러 생물에서 존재하는 혈전용해성 물질을 광범위한 탐색 기술을 활용하여 새로운 혈전용해제로 개발하려는 많은 시도가 이루어져, 이미 은행잎 추출성분과 지렁이로부터 분리된 6가지의 혈전용해제들이 개발되어 상품화되었다.한편, 미생물에서 분리된 스타필로키나제는 인간 플라즈미노겐의 강력한 활성제로 알려져 있는 단백질로서, 혈전용해능이 우수하여 새로운 혈전용해제로 기대되고 있다.본 기술에서는 스타필로코커스 오레우스 균주에서 혈전용해 활성을 가진 물질을 분비함을 확인하고, 이로부터 스타필로키나제 유전자를 분리하고 아미노산 서열을 분석하여 다른 스타필로키나제와 비교한 결과, 기존에 알려진 3개의 스타필로키나제 변형체들은 아미노산 번호 11번, 34번, 36번, 43번 위치에서 아미노산이 치환되었는데, 본 스타필로카나제는 지금까지 알려지지 않은 33번 위치에서 아미노산이 치환된 것으로 나타났으며, 또한 아미노산 번호 36번 위치의 아미노산은 기존의 변형체가 글리신이나 라이신으로 치환되는데 반하여 음 전하를 가지는 글루탐산으로 치환되어 전체 단백질의 구조에 영향을 주는 전하 변화가 있는 새로운 스타필로키나제임을 알 수 있다. 본 스타필로키나제는 혈전용해 활성이 우수하여 급성 심근경색, 뇌경색 등을 치료하는 혈전용해제로 이용될 수 있다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-06-22
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일반기술
보건·의료 > 약물작용점 발굴 기술
인간 면역결핍 바이러스(HIV-1)에서 항원성이 높은 부위인 표면 단백질 gp41에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주로서, HIV-1 표면 단백질 gp41중의 MAP-1의 합성 펩타이드를 마우스에 면역화시켜 융합세포주를 제조하고 이로부터 펩타이드의 아미노산 서열에 높은 특이성을 보이는 마우스 단일클론 항체를 분리하여 그의 항원 특이성 등을 확인함으로써 HIV-1 감염을 효과적으로 진단하는 항체를 얻는다. 우선 HIV-1이 표면 단백질 gp41중 아미노산 번호 584-618 서열의 35개 아미노산으로 이루어진 직쇄상 펩타이드 2개를 포함하는 MAP-1 합성 펩타이드를 설계하여 제조한 다음, MAP-1 합성 펩타이드를 이용하여 마우스를 면역화시키고 이로부터 추출한 비장세포와 마이엘로마 세포를 융합시킨 후 MAP-1 합성 펩타이드 및 HIV-1 표면 단백질 등에 특이성을 보이는 세포 클론을 효소면역측정법으로 선별함으로써, HIV-1의 표면 단백질 gp41을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 제조하는 방법이다.단일클론 항체는 다양한 반응 시약을 포함하는 HIV-1 항원 또는 항체 진단키트 등을 개발하는데 이용될 수 있으므로, 면역결핍 질환 등을 효과적으로 진단할 수 있다후천성 면역결핍증(AIDS)을 유발하는 주요한 병원체로 알려진 HIV-1은 생체에 감염되는 경우, 바이러스의 표면 단백질인 gp120 단백질이 생체 면역계에 존재하는 T세포에 있는 CD4에 부착하고 이는 다시 표면 단백질 gp41과 융합하는 과정 등을 거쳐 바이러스 입자가 세포내로 들어간다고 알려져 있다. AIDS를 진단하기 위하여 HIV 항체 또는 항원을 검색하는 효소면역측정법이 많이 활용되는데, 실제로 HIV-1의 gp41 단백질, gp36 단백질 및 이들로부터 유래한 펩타이드들이 항원으로 이용되었다. 그러나, 재조합 단백질 항원들은 정제 과정이 복잡하여 가격이 비싸고, 펩타이드 항원은 비용은 저렴하나 코팅 효율과 항원성이 낮은 단점이 있었다.본 기술은 면역화에 사용되는 펩타이드를 다가지 항원 펩타이드(multiple antigenic peptide, MAP) 형태로 합성하여 바이러스 항체를 검색하는 강력한 코팅 항원뿐만 아니라, 백신 등을 개발하는데 사용되는 효과적인 항원이 될 수 있도록 제조하였다.제조된 단일클론 항체는 알코올 분해효소와는 전혀 반응하지 않는 반면, HIV-1 gp41 펩타이드를 포함하는 HIV-1 gp160 단백질과는 특이적으로 반응하므로 마우스 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체는 사람의 혈액 내에 존재하는 HIV-1의 표면 단백질 항원을 검색하는데 사용될 수 있다. 또한, 이를 AIDS 환자의 혈청에 존재하는 HIV-1 표면 단백질 gp41에 대한 항체와 경쟁적으로 반응시키면 환자 혈청 내의 상기 항체의 농도를 결정할 수 있는 장점이 있다. 따라서 후천성면역결핍증, 면역결핍질환등을 진단하는 데 유용하게 이용될 수 있다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-06-21
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일반기술
보건·의료 > 약물작용점 발굴 기술
B형 간염 바이러스(HBV)의 X 단백질에 특이적으로 반응하는 단일클론 항체를 이용하여 간질환을 진단하는 것으로, HBV 단백질중 HBV에 의한 간염을 간암으로 이행시키는 기작에 직접적으로 관여하는 것으로 추정되는 조절 단백질인 X 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 단일클론 항체를 개발하고, 이를 이용하여 인체 간질환을 임상학적으로 진단할 수 있는 진단용 조성물이다. 먼저 HBV의 X 단백질 면역원을 제조하여 생쥐에 주사한 다음, 생쥐의 비장세포를 수득하여 생쥐의 마이엘로마 세포와 융합시켜 X 단백질 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포군을 엘리자 분석방법(ELISA)으로 선별한 후, 수득된 하이브리도마 세포주로부터 항-X 단일클론 항체 IgM을 분리정제하고, 이를 유효성분으로 포함하는 간질환 진단용 조성물을 제조한다.HBV는 DNA 바이러스로서 감염이 되면 간염 또는 간경변이 유발되고 만성간염으로 되는 경우 간암으로까지 이행한다고 알려져 있다. HBV의 조절 단백질인 X 단백질은 약 154 개의 아미노산으로 구성된 분자량 17kDa 정도의 단백질로서, HBV에 의해 유발된 간염에서 간암으로 이행하는 기작에 직접적으로 관여하는 것으로 추측되고 있다. 따라서, X 단백질에 대한 단일클론 항체를 사용하면, 혈액 내의 X 단백질의 수준을 정확히 측정할 수 있어 간염 바이러스에 의해 유발되는 질환인 간염 및 간암 등을 확실하게 진단할 수 있을 것이다. 본 기술에서는 정상인과 급성 및 만성 간염환자에서는 HBV의 X 항원에 대한 항체를 나타내지 않았으나, 간경변환자의 경우는 11명중 7명이, 간암 환자는 19명중 12명이 항체반응을 나타내었다. 이는 만성 간염 환자가 간경변이나 간암으로 이환되는 과정에서 항원의 HBV X 단백질의 발현이 빈번하게 또는 고농도로 이루어져 이에 대한 항체 생성이 유발된다는 것을 알 수 있다. 또, 본 기술의 혈청내 HBV X 항원은 항체 측정과 마찬가지로 정상인과 급성, 만성간염 환자에서는 검출되지 않았으며, 간경변환자와 간암환자에서만 낮은 빈도로 검출되었다. 이는 항체와 달리 HBV X 항원의 분자량이 매우 적어 항원성이 낮은 것에 기인하는 것으로 여겨진다. 그러나 HBV X 항원에 대해 항체가 생성되는 양상이 간경변 환자와 간암 환자에게서 주로 나타나는 것으로 보아 HBV X 항원과 항체의 검색이 만성간염에서 간경변이나 간암으로서의 이환과 상관관계가 있는 것을 알 수 있다. 항-X 단일클론 항체 IgM을 이용하여 발현 암세포를 검색할 수 있으며, 간염 바이러스에 의한 간질환, 간염 그리고 간암과의 상관관계 및 임상적인 진단용으로도 사용할 수 있을 것이다.
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-06-21
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일반기술
보건·의료 > 약물작용점 발굴 기술
인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1)의 주요한 덮개(major capsid) 단백질 p24 에 대한 단일클론 항체, 이를 생산하는 융합세포주와 p24의 일부 아미노산 서열을 포함하는 다가지 항원 펩타이드에 관한 것으로, 항-폴리클론 HIV-1 p24 염소 항체에 대하여 매우 반응성이 높은 HIV-1 p24 단백질의 합성 펩타이드를 이용하여, p24 단백질에 높은 특이성을 나타내는 마우스 단일클론 항체를 분리하여 그의 항원 특이성 등을 확인함으로써 HIV-1 감염을 진단하는 항체를 얻는다. HIV-1 p24 단백질중 가장 항원성이 높은 부분인 아미노산 번호 202-221의 서열을 포함하는 직쇄상 펩타이드를 4개의 가지로 된 항원 펩타이드 MAP-7을 마우스에 면역화시키고 이로부터 추출한 비장세포와 마이엘로마 세포를 기존의 방법으로 융합시킨 후 마우스 단일클론 항체를 효소특정법으로 선별함으로써, HIV-1 p24 단백질을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 제조한다. 마우스 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체는 HIV-1 p24 단백질을 인식하는 높은 특이성을 가지므로, 상기 단일클론 항체 및 HIV-1 항원을 이용한 진단키트의 개발로 면역결핍 질환 및 HIV 감염 초기의 환자를 효과적으로 진단하는데 유용하게 이용할 수 있을 것이다후천성 면역결핍증(AIDS)을 유발하는 주요한 병원체로 알려진 HIV-1의 감염여부 진단에는 HIV의 항체항원을 검색하는 효소면역측정법이 많이 활용되는데, 종래의 재조합 단백질 항원들은 정제 과정이 복잡하여 가격이 비싸고, 또 펩타이드 항원은 비용은 저렴하나 코팅 효율과 항원성이 낮은 단점이 있었다.한편 HIV-1 p24는 HIV 유래의 RNA와 복제 효소 등을 보호하는 덮개 역할을 하며, 바이러스 입자의 형성에 중요한 역할을 담당하며, HIV의 감염 초기에 HIV-1 p24 단백질 항원의 농도가 매우 높아지는 것으로 알려져 있다. 따라서 HIV-1 양성 혈청내 p24 단백질의 존재는 HIV 감염을 알려주는 지표가 된다. 본 기술에서는 단일클론 항체가 HIV-1 p24(202-221) 합성 펩타이드 및 p24 단백질에 대하여 선별적으로 높은 항원 인식능력을 나타냄을 확인하였고, MAP-7 합성 펩타이드 및 p24 단백질과 특이적인 효소면역반응을 수행함을 확인하였다. 또한 마우스 융합세포주가 생산하는 단일클론 항체는 사람의 혈액내에 존재하는 HIV-1 의 p24 단백질 항원과 플레이트에 코팅한 p24 펩타이드를 경쟁적으로 반응시키면 HIV 환자 혈청내의 p24 항원의 농도를 결정할 수 있을 뿐만 아니라 HIV 진단에 이용될 수 있다. 따라서 본 단일클론 항체는 HIV-1 p24 단백질 항원 진단키트를 개발하는데 이용될 수 있다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-06-21
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일반기술
농림·수산 > 기타 가공 기술
고농도의 염에서 높은 활성을 나타내며 루이신 잔기에 대해 높은 기질특이성을 가지는 루이신-아미노펩티다제에 관한 것으로서 , 고염의 존재하에서도 아미노펩티다제의 활성이 유지 또는 증가되는 아미노펩티다제를 개발함으로써 높은 농도의 소금을 함유하고 있는 젓갈, 간장 또는 된장 등 단백질 발효 식품의 품질과 보존육의 풍미를 개선하는 수단으로 이용 할 수 있다. 멸치젓으로부터 바실러스속에 속하는 신규한 균주를 분리하고, 이 균주를 배양하여 원심분리에 의해 얻어진 배양액을 ammoniumsulfate에 의해 분획한 후 양이온 및 음이온 교환크로마토그라피와 gel-filtration을 수행함으로서 고활성의 루이신-아미노펩티다제 효소를 정제한다.본 효소는 내염성이 높기 때문에 우리나라의 염 농도가 높은 식품에 대해서도 그 이용 효과가 높은 것으로 기대된다. 이밖에도 미생물 배양을 이용하여 생산되므로, 저가로 대량의 루이신-아미노펩티다제를 제공할 수 있기 때문에 시약 등 공업적인 용도로도 널리 이용될 수 있다식용육의 보존중에 생기는 유리 아미노산이 보존육의 질, 맛, 풍미를 향상시킨다는 사실은 널리 알려져 있으며, 특히 아미노펩티다제는 식육가공분야에 있어서 육질의 개선, 맛의 향상 등의 수단으로서 유용하다. 한편 종래의 젓갈, 간장 또는 된장 등 단백질 발효 식품에 있어서 고농도의 소금을 함유하고 있으므로 풍미를 개선하기 위한 목적으로 아미노펩티다제를 사용할 경우에는 그 활성이 감소하는 경향이 있다. 이러한 결점을 개선하기 위해서는 고염의 존재하에서도 아미노펩티다제의 활성이 유지 또는 증가되며 높은 기질특이성을 가지는 아미노펩티다제의 개발이 요구되어 왔다. 이에 본 기술은 저가, 대량의 높은 기질특이성을 나타내면서도 고농도 염의 존재하에서도 활성이 유지되는 루이신-아미노펩티다제와 이를 생산하는 신규한 균주를 개발하였다. 신규한 루이신-아미노펩티다제는 분자량이 58kDa 로서, L-루이신 잔기에 대해서 높은 특이성을 가지며, 4.5M의 NaCl 농도에서도 높은 효소활성을 나타낸다. 또 상기 효소는 금속단백질 분해효소로서의 특성을 가지는 등 지금까지 알려진 바 없는 새로운 효소이다.신규의 아미노펩티다제를 이용하면 고염의 존재하에서 펩타이드를 분해할 수 있으므로 단백질 가수분해를 기본으로 하는 식품가공 산업분야에 널리 적용할 수 있다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-17
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일반기술
보건·의료 > 의약품 제제 개발 기술
신이(Magnoliae flos) 추출물과 신이로부터 분리한 리그난 화합물 및 이를 유효 성분으로 하는 혈소판 활성화인자(PAF; platelet-activating factor) 수용체에 작용하는 길항제에 관한 기술이다. 본 기술은 천연식물인 신이로부터 PAF 수용체에 작용하는 길항활성을 가지는 물질을 확인하여 이로부터 2종의 새로운 리그난 화합물을 분리하고, 이 화합물을 이용하여 PAF 수용체의 작용을 저해하는 길항활성을 조사함으로써 PAF 수용체와 관련된 염증 질환의 예방 및 치료제 등을 제공한다. 본 기술은 신이로부터 길항활성을 발견하고, 신이를 저급 알코올로 추출하고 여과하여 감압 농축한 다음 증류수로 현탁하고 헥산으로 세척하여 에틸아세테이트로 다시 추출하고 흡착 크로마토그래피를 반복 수행하여 새로운 리그난 화합물을 제조하고 이들 및 그 유도체들을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 PAF 인자 수용체에 작용하는 길항제로 제조하는 기술이다. 본 기술에 의하면 상기 리그난 화합물 및 신이 추출물은 PAF 수용체에 대한 길항활성이 매우 우수하였으므로, PAF와 관련된 염증 질환의 예방 및 치료제, 치료보조제 또는 임신과 난자 착상의 조절제로 유용하게 사용될 수 있다PAF는 염증 매개물질인 히스타민, 루코트리엔 및 프로스타글란딘 등보다 저농도에서 염증 세포를 활성화할 수 있어 다른 염증 매개물질이 합성되어 방출되는 과정을 유도하는 급성 염증반응의 개시인자로 작용한다. 따라서 혈소판 활성화 인자가 작용하는 염증 반응이 활성화되면 기관지 수축, 천식, 조직이식 거부반응, 내독소에 의한 쇼크, 위궤양, 급성 알레르기 반응, 과민성 피부염 등 다양한 염증 질환이 유발된다. 한편, 신이(Magnoliae flos)는 목련과에 속하는 중국산 신이의 피지 않은 꽃봉오리(화뢰)를 건조한 것으로 매운 맛을 가지고 있다. 예로부터 신이는 거풍, 통규의 효능이 있어 두통, 악성비점막궤양, 축농증 및 치통 등을 치료하는데 사용되었고, 일부 방향약으로도 사용되었다. 본 기술에서는 전통 천연식물로부터 PAF 수용체에 작용하여 길항활성을 나타내는 새로운 물질을 얻기 위한 과정에서 신이로부터 길항활성을 발견하여, 새로운 리그난 화합물을 분리하였다. 본 기술의 PAF 수용체에 작용하는 길항제는 생체내 또는 생체외에서 PAF의 활성조절에 이용될 수 있는데, 즉 천식, 알레르기, 관절염, 신장염, 비염, 아토피성 피부염, 심장과민증, 내독소 쇼크, 중추신경계 손상 또는 장기(조직)이식 거부반응 등의 질환의 예방 및 치료제, 임신과 난자착상 조절제로서 유용하게 사용될 수 있다
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- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-06-23
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일반기술
보건·의료 > 임상시험·진단관련
사람 혈구에 대한 생쥐 응집 단일클론 항체의 Fab 부위와 이를 암호하는 중쇄와 경쇄 cDNA 유전자, 그들의 염기 서열 및 이를 포함하는 플라스미드 벡터에 관한 기술이다.본 기술은 인간화 항체 등을 개발하는데 유용한 사람 혈구에 대한 생쥐 응집 항체 Fab 부위의 유전자를 생쥐세포 클론 HAG 12에서 클로닝하여 그의 염기서열을 결정하고 그의 특성을 확인함으로써 바이러스 감염을 효과적으로 예방하고 진단하는 방법이다.본 기술은 생쥐세포 클론 HAG 12로부터 RNA를 추출하여 사람 혈구에 대한 생쥐 응집 단일클론 항체의 Fab 부위를 암호하는 경쇄 및 중쇄 유전자의 cDNA를 합성하고, 그 아미노산 서열 및 염기서열을 분석하여 제공하고 있으며, 상기 cDNA 유전자들을 플라스미드 벡터에 각각 클로닝하여 제조된 플라스미드 벡터 pYBM-AL 및 pYBM-AH를 제공한다. 본 기술에 의하면 상기 cDNA 유전자는 기능적이므로 이를 인간 항체 유전자와 결합시켜 발현시키면 HIV, HBV, CMV 및 기타 바이러스 등 혈액내 항원을 진단하는데 유용하게 사용할 수 있다인간의 질병에 대한 진단이나 치료에 있어서 항원-항체 반응을 이용한 면역학적 방법이 많이 이용되고 있다. 근래에는 단일클론 항체를 이종의 항원을 화학적으로 항체에 결합시킨 복합 항체의 형태나 항원과 결합하는 부위의 유전자를 조절한 형태 등의 키메라 항체로 개량하려는 시도들이 있어, 질환의 진단이나 치료에 있어 그 비중이 증가되고 있다. 한편 인간화 항체는 생쥐단일클론 항체의 가변영역 중에서 항원과 직접 결합하는 CDRs 영역을 사람 항체에 이식시켜 제조할 수 있다. 이를 위해서는 생쥐 항체 가변영역을 얻고 이를 유전자 재조합 방법으로 사람 항체의 유전자와 융합시켜 동물세포에서 발현시킨다. 본 기술의 사람 혈구에 대한 생쥐 응집 단일클론 항체 유전자의 항원-결합 절편 부위의 중쇄와 경쇄를 암호하는 cDNA는 모두 항체의 일반적인 특성 및 그 이소타입에 상응하는 염기서열들을 소유하고 있어 이들 항체 cDNA가 기능적인 것임을 시사해준다. 본 기술에서 개발된 cDNA를 이용하여 공지의 방법에 따라 생쥐 단일클론 항체의 Fab 부위 중에서 항원과 직접 결합하는 CDRs 영역을 사람항체에 이식시켜 인간화 항체를 제조하면, 인체에 주사하였을 때 면역반응을 최소화할 수 있고 인간의 적혈구에 결합하여 응집반응을 일으키는 재조합 단일클론 항체를 대량 생산할 수 있으며, 이것을 이용하여 사람 적혈구와 관련된 HIV 등의 혈액내 항원을 진단하는 인간화 항체를 개발하는데 사용할 수 있다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-06-23
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보건·의료 > 의약품 제제 개발 기술
삼백초로부터 분리정제한 세포접착저해활성을 나타내는테르페노드 화합물인 사우루릭산(saururic acid) 에 관한 기술이다. 삼백초뿌리를 알코올용액에 침지하여 얻은 추출액을 실리카겔 크로마토그래피를 수행하고, 활성이 있는 분획을 메탄올을 용매로 하여 크로마토그래피한 후 HPLC로 용출하여 활성이 있는 사우루릭산 분획을 얻어 이를 생쥐 흑색종세포인 B16-Fl에 투여한결과 강한 세포접착 저해활성을 확인하였다. 신규화합물 사우루릭산은 세포접착 저해작용이 우수하여 암세포가 세포외 매트릭스의 일종인 라미닌에 결합하는 것을 저해하는 작용이 있으므로, 암전이의 예방 및 치료제로 이용될 수 있다.세포접착현상은 세포정보전달, 암, 면역, 신경, 발생, 세포증식, 세포분화, 세포인식 등의 여러 가지 생명현상에 관여하고 있는 것으로 알려졌다. 암세포의 모세혈관 벽의 세포외 기질과의 접착은 세포외 기질 구성성분인 파이브로넥틴, 라미닌, 바이트로넥틴 등에 존재하는 접착에 관여하는 펩타이드와 암세포의 표면에서 발현되는 인테그린과 같은 접착분자의 상호작용에 의해 이루어진다. 최근 이러한 기능을 조절제어하여 암전이를 억제할 수 있는 세포외 매트릭스인 파이브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 등에서 유래한 펩타이드가 개발되었는데, 이와 같은 물질들은 혈관내에서 단백질분해효소의 작용에의 분해되는 결점이 있어 새로운 구조의 화합물의 개발이 요구되어 왔다. 이에 세포의 접착을 억제하는 활성이 삼백초의 메탄올 추출물에 존재하는 것을 발견하고 이들 활성성분을 추적한 결과, 신규화합물인 사우루릭산을 분리하였다.라미닌으로 코팅한 마이크로플레이트에 B16-F1 세포현탁액을 첨가하여 사우루릭산의 암세포접착저해활성을 확인한 결과, 세포접착을 50% 저해하는 농도가 4.1 μg/mL인 것으로 나타나, 사우루릭산이 세포접착에 의한 질환의 치료제로서 사용될 수 있음을 보여준다
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- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-06-23
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일반기술
보건·의료 > 의약품 제제 개발 기술
B형 간염바이러스(HBV) 표면항원인 S 항원과 프리-S2 항원을 동시에 인식하는 이중특이항체와 그의 유전자, 이 항체를 생산하는 세포주 및 이를 이용하여 간염 항체를 얻는 방법이다. 본 기술은 두 개의 HBV 표면항원에 대한 항체를 이용하여 이들의 항원을 인식하는 영역을 동시에 2개씩 포함하도록 구성된 이중특이 항체를 개발하고, 이들의 HBV 입자에 대한 결합력 등이 기존의 단일클론 항체에 비하여 탁월하게 높아 HBV 입자를 효율적으로 중화시키도록 함으로써 효과적인 간염 예방제 및 치료제를 제공한다. 본 기술은 HBV의 S 항원을 인식하는 부위, 연결 펩타이드, 프리-S2 항원을 인식하는 부위 및 사람 유래의 항체 Fc 부위로 구성되어, 이를 동시에 인식할 수 있는 간염 항체의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하고, 이를 중국 햄스터 난소유래(CHO) 세포에 형질전환시킨 다음 메토트렉세이트를 포함하는 배지를 이용하여 간염 항체를 대량 생산하는 세포주를 선별하는 과정으로 이중특이성을 가지는 간염 항체를 제조하여 정제하는 새로운 간염 항체의 제조방법이다. 본 기술에 의하면 상기 이중특이항체는 4가 항체로서 HBV 입자의 프리-S2 항원 또는 S 항원 중의 어느 하나와도 반응하며, 그 결합능이 탁월하여 기존의 단일클론 항체보다도 더 효과적으로 HBV 입자를 면역침강시키므로 더욱 우수한 간염의 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다HBV는 간염의 주된 병원체인 DNA 바이러스로서, 사람에 침입하여 급성 또는 만성 간염을 일으키는데, 이러한 간염이 악화될 경우 간경화 또는 간암으로 이행된다. HBV 입자는 S 항원, 프리-S1 항원, 프리-S2 항원의 3가지 표면항원을 가지는데, 이들 항원은 바이러스를 중화하는 항체 또는 그 외 보호 항체의 생산을 유도한다. 따라서 상기 표면항원을 이용하여 HBV 감염을 예방하거나 치료하려는 많은 연구들이 시도되어 표면항원에 대한 단일클론 항체 등이 다양하게 생산되었다. 그러나, 아직까지 HBV 감염시에 S 항원 또는 프리-S 항원에 대한 두 가지 이상의 항체를 혼합하여 사용한 연구 또는 상기 두 항원을 함께 인지하는 항체를 이용한 연구는 보고된 바 없었다. 이에 본 기술에서는 B형 간염 바이러스의 다른 두 항원을 동시에 인식하여 효과적으로 바이러스를 중화시킴으로써 간염의 예방 및 치료에 사용될 수 있는 이중특이항체를 개발하였다. 본 기술에의 이중특이항체를 전기영동으로 분석한 결과, 환원된 항체의 분자량은 75kDa이고 환원시키지 않은 항체는 보통의 항체와 분자량이 동일하여 다이머 형태였다. 본 기술의 이중특이항체 TBSIg는 4가(tetravalent)의 항체로서 S 항원과 프리-S2 항원에 모두 결합하는 탁월한 이중특이성을 나타내었다. 또 본 이중특이항체 TBSIg는 HBV 입자와 친화도가 높아 HBV 입자를 면역침강시켰으며, 그 결합능은 대조군에 비해 약 4배정도 더 높게 나타나 매우 효율적인 항체임을 알 수 있었다
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- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-06-20
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보건·의료 > 의약품 제제 개발 기술
사람 글루타민 합성효소(GS; glutamine synthase) 유전자를 이용하여 동물세포에서 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 방법으로, 메티오닌 설폭시민(MSX; methionine sulfoximin)에 의해 증폭되는 GS 유전자를 이용하여 외래유전자를 대량으로 발현할 수 있는 발현벡터를 제조하고, 이를 이용하여 재조합 에리트로포이에틴(EPO)을 동물세포에서 간편하게 증폭시켜 재조합 EPO 단백질을 생산한다. 상술하면 MSX에 의해 증폭되는 사람 GS 유전자를 이용하여 동물세포 발현벡터를 제작하고, 여기에 EPO 유전자를 삽입한 발현벡터 pcDNA-EPO-dE1-gs를 제작한 후, 외래 유전자를 삽입하여 재조합 단백질을 대량 생산하는데 사용될 수 있는 발현 카세트(cassette)를 포함하는 발현벡터 pcDNA-gs를 제작한 다음, 이 발현벡터를 동물세포(CHO)에 형질전환시키고 MSX 농도를 증가시킨 배지에 배양하여 얻은 세포주를 이용함으로써 EPO를 포함한 유용한 재조합 단백질을 고수율로 생산한다. 본 기술에 의하면 단일 단계의 증폭 과정만으로도 다양한 재조합 단백질을 고수율로 생산하는 세포주를 용이하게 선발할 수 있어, 이로부터 활성이 우수한 재조합 단백질을 효과적으로 생산할 수 있다.EPO는 적혈구 형성자극인자라고도 하는 산성 당단백질 호르몬으로서 EPO를 생산하지 못하는 빈혈증을 치료하는데 사용되고 있으며, 류마티스성 관절염 환자 또는 암 환자에서의 빈혈증 치료, 수술전후의 수혈 대체 등에 이용되고 있다. 지금까지 EPO는 주로 양의 혈장, 사람의 오줌 및 재생불량성 빈혈 환자의 오줌 등에서 추출되었는데, 이를 치료에 사용하기에는 양이 충분하지 않아 널리 이용되지 못하였다. 따라서 EPO를 유전공학적 방법으로 생산하기 위하여 많은 시도들이 이루어지고 있다. 한편 GS는 모든 세포에 발현되는 효소로서 선택 마커로 사용될 수 있고, 이 효소의 억제제인 MSX을 처리하면 높은 복사본 수로 유전자를 증폭시킬 수 있는 특징이 있다. 본 기술의 발현 벡터는 MSX에 의하여 증폭되는 사람 GS 유전자를 이용함으로써, 발현 벡터로 형질전환된 세포에서 외래 유전자를 단일 단계로 간편하고 효과적으로 증폭시킬 수 있고 이로부터 활성이 우수한 형태의 재조합 단백질, 특히 재조합 EPO을 고수율로 생산할 수 있다. 기존의 Cockette 등이 보고한 TIMP 생산성과 비교하여 3배 이상 효율적인 것으로 나타나, 사람 GS 유전자와 enhancer 부위를 제거한 SV40 프로모터를 포함하는 본 기술의 발현벡터는 CHO 세포에서 유전자를 증폭시키는데 매우 유용함을 알 수 있다. 특히, 본 기술은 기존에 많이 사용하여 온 dhfr 유전자를 이용한 경우보다도 더욱 효율적인 것이다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-17
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일반기술
보건·의료 > 의약품 제제 개발 기술
동물세포에서 p53 항암 유전자를 선택적으로 발현할 수 있는 발현 벡터 및 이를 인체 암 세포주에 형질전환시켜 암억제관련 유전자, 항암제 등을 탐색하는 용도로 사용한다. 테트라사이클린에 의존하는 프로모터 pCMV*-1의 하류에 p53 항암 유전자를 포함하고, 엡스타인바 바이러스 복제기점을 포함하며, 선택 마커로 네오마이신에 대한 내성 유전자를 포함하는 발현 벡터 pDS1293과 엡스타인바 바이러스 복제기점에 작용하는 EBNA-1 단백질의 유전자를 포함하고, 선택마커로 하이그로마이신 B에 대한 내성 유전자를 포함하는 발현 벡터 pETH를 제조하고, 이 발현 벡터 pDS1293 및 pETH를 순차적으로 인체 방광암 세포주에 형질전환시켜 테트라사이클린을 함유하는 배양액에서 p53 항암 유전자를 선택적으로 발현하는 암 세포주 EJ-p53-4를 선별하였다. 인체 암 세포주는 테트라사이클린에 의존하여 p53 항암 유전자를 효과적으로 발현시키므로 p53 유전자에 의하여 조절되는 암억제 관련 유용 유전자 및 새로운 항암제의 탐색에 널리 사용될 수 있다p53 유전자는 항암 유전자로서, 50-60%의 암 환자의 경우 이 유전자에 돌연변이 또는 결손이 일어나 p53 단백질이 제대로 된 활성을 나타내지 못하여 암이 유발되는 것으로 보고되어 있다. 또, p53 항암 유전자의 기능을 상실하고 있는 암세포를 정상 p53 항암 유전자로 형질전환시키면 형질전환된 암세포는 사멸되거나 암증식이 중단된다, 이러한 p53 항암 유전자 및 그 단백질의 유용성이 널리 알려져 전세계적으로 p53 항암 단백질을 이용한 항암 유전자 요법 및 새로운 항암제 등의 개발이 시도되고 있다. 이에 p53 항암 유전자를 선택적으로 발현하여 새로운 항암 표적인자 및 항암제 등을 탐색하는데 유용하게 사용될 수 있는 인체 암 세포주를 제공한다.발현 벡터는 p53 항암 유전자가 고효율로 세포 내에 도입되게 하는 엡스테인바 바이러스의 복제기점 및 선택 마커로 네오마이신에 대한 내성 유전자를 가지고 있으며, p53 항암 유전자를 선택적으로 발현하는 암 세포주의 형태를 테트라사이클린이 포함된 배양액 등에 각각 2주일 동안 배양한 다음 김사 용액으로 세포를 염색하여 현미경으로 관찰하여 본 기술의 암세포주를 선별하였고, 웨스턴 블럿을 수행하여 p53 유전자의 선택적인 발현을 확인하였다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-17
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일반기술
생명과학 > 기타 생물공정·대사공학
유기용매 내성을 가지는 에스테라제를 생성하는 슈도모나스속 신균주인 스튜트제리에 관한 것으로, 본 기술의 목적은 유기용매에 내성이 있는 균주만을 분리함으로써 유기용매의 존재하에서도 내성을 나타내며 에스테르결합을 가수분해하여 생리활성물질의 광학합성에 주요한 수단으로 이용되는 에스테라제를 생산할 수 있는 슈도모나스속 신균주를 제공하는 것이다.본 기술은 LB 배지에 유기용매인 사이클로헥산을 첨가한 균분리용 배지에 폐수, 세차장 퇴적토, 주유소 토양, 차량정비소 토양 등을 균 분리시료로 첨가하여 진탕배양 할 때, 5%, 25%로 유기용매 농도를 점진적으로 증가시킨 배지에 이동시키면서 균의 생육여부를 확인하여 유기용매 내성균인 슈도모나스 스튜트제리 CH-120을 분리해내고, 이 내성균에 의해 생산된 에스테라제의 유기용매에 대한 안정성을 조사함으로써, 유기용매 내성 에스테라즈를 생성하는 슈도모나스속 신균주를 분리 동정하는 방법이다.본 기술에 의하면 상기 신균주 슈도모나스 스튜트제리 CH-120이 생산하는 에스테라제는 다양한 유기용매에 대해 대부분 활성을 잃지 않고 안정된 효과를 나타낸다에스테라제(Esterase)란 에스테르결합을 가수분해하는 효소의 총칭으로서, 에스테라제는 에스테르 결합의 분해나 합성 반응시, 테트라하이드로이소퀴놀라인, 아자바이사이클로노난, 인돌마이신과 같은 생리활성물질의 광학합성에 유용하게 이용될 수 있다. 그러나, 특정의 아세톤, 알콜류 등의 유기용매가 효소반응의 매체로 사용되는 경우에는, 효소반응에 적용된 효소와 유기용매사이의 단백질 변성반응에 의해 에스테라제는 쉽게 실활되며 미생물 자체에도 아주 강한 독성을 나타내는 문제가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 효소의 고정화 또는 단백질공학 수법을 이용하여 유기용매계에서 효소를 안정화시킬 수 있는 개선방법이 있으나, 고정화의 비용, 안정성의 상실, 단백질공학 수법의 난이성 등의 문제점이 있다.본 기술에서는 유기용매에 내성을 나타내는 에스테라제를 생성하는 신규주 슈도모나스 스튜트제리 CH-120을 분리 동정하였는데, 이 균주의 시간별 에스테라제 역가를 측정한 결과 사이클로헥산이 첨가된 배지에서 첨가하지 않은 경우에 비하여 활성이 50% 정도 증가되었고, 특히 균체 대비활성에 있어서는 사이클로헥산을 첨가한 경우 약 3배 정도 증가하는 것으로 나타났다. 또 본 기술의 에스테라제는 아세톤과 에탄올에서도 역가의 감소가 관찰되지 않았으며, 유기용매에 대한 효소안정성이 가장 낮은 것으로 나타난 클로로포름에서도 유기용매를 첨가하지 않은 대조군과 대비하여 55%의 역가를 유지하는 것으로 나타나 유기용매에 대해 매우 안정한 효소임을 알 수 있다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-18
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일반기술
보건·의료 > 임상시험·진단관련
생쥐 유래의 퍼옥시리독신을 코딩하고 있는 게놈 DNA상의 유전자 염기 서열에 관한 기술이다.생쥐 유래의 퍼옥시리독신 유전자 Prx Ⅱ-1과 프로모터(promoter), Prx Ⅱ-2, Prx Ⅱ-3의 염기서열 및 이들의 구조를 분석함으로써, 이들 퍼옥시리독신 발현효율의 조절뿐만 아니라 퍼옥시리독신이 결여된 질환을 갖는 동물모델을 개발하는데 이용하고자 하는 것이다. 본 기술은 생쥐 스트레인 129로부터 Prx II 유전자를 스크리닝하여 그 유전자 전사를 확인하고, Prx Ⅱ 유전자함유 플라스미드 DNA 벡터를 제조한 다음, 세 가지 형태의 게놈 Prx Ⅱ(Prx Ⅱ-1, Prx Ⅱ-2, Prx Ⅱ-3)를 분리하여 각 유전자의 DNA 염기서열을 결정하고 그 구조를 분석하는 방법이다.퍼옥시리독신은 활성산소를 제거하는 효소단백질로서, 퍼옥시리독신 유전자의 하나인 Prx Ⅱ에 대해 생쥐의 뇌로부터 cDNA가 보고된 바 있는데, 이들 퍼옥시리독신의 발현효율을 높이거나 Prx가 결여된 질환을 갖는 모델동물을 개발하기에는 cDNA의 발현효율이 낮고 Prx 결손 모델동물제작에는 게놈 DNA의 사용이 절대적으로 요구된다는 점 때문에 기술적으로 바람직하지 않았다. 따라서, 게놈 DNA의 염기서열 및 이들의 분리가 절실히 요구되고 있어 생쥐 유래 퍼옥시리독신 유전자 Prx Ⅱ-1과 프로모터, Prx Ⅱ-2 및Prx Ⅱ-3의 염기서열을 제공한다. 본 기술에서의 Prx Ⅱ-1의 전사단위는 4.5kb 크기로서, 6개의 엑손과 5개의 인트론으로 구성되는데, 6개의 엑손으로부터 198 아미노산을 암호화하는 1.1 kb의 mRNA가 제조된다. 또, Prx Ⅱ-1 유전자 프로모터가 존재하는 810bp의 염기서열에는, 가까운 부위에는 Sp1, NF1, AP-1또는 AP-2 결합부위가, 먼 부위에는 반쪽의 열충격전사인자(HSF) 결합부위가 17개 이상 분포되어 있다. Prx Ⅱ-2는 약 940bp 크기의 단일 엑손으로, 597 bp의 ORF를 유지하고 있으며, Prx Ⅱ-3은 약 750bp 크기로써 Prx Ⅱ-2와 비교하여 191 bp가 손실된 단일 엑손으로, 453bp의 ORF를 갖고 있다. 그러나, Prx Ⅱ-2와 Prx Ⅱ-3 유전자는 mRNA로 전사된다는 증거를 발견하지 못하였으며, 이로써 레트로트랜스포지션에 의한 유사유전자로 여겨진다. 본 기술에 의해 생쥐 유래의 퍼옥시리독신 유전자 Prx Ⅱ-1과 프로모터, Prx Ⅱ-2, Prx Ⅱ-3의 염기서열을 규명함으로써, 퍼옥시리독신 발현효율을 적절히 조절할 수 있을 뿐만 아니라 퍼옥시리독신이 결여된 질환을 갖는 모델동물을 개발할 수 있어 산업상 유용한 효과가 있다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-06-23
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일반기술
생명과학 > 기타 생물공정·대사공학
주반응으로 UDP-xylose를 합성하며, 부반응으로서 TDP-glucose, UDP-glucose, UDP-mannose, UDP-N-acetylglucosamine, UDP-galactose 등 다양한 당핵산염을 합성하는 신규한 UDP-xylose pyrophosphorylase(UXPase)에 관한 것이다. 본 기술의 목적은 신규한 UXPase 효소의 유전자 염기서열을 결정하고, 이 유전자를 포함하는 발현벡터 및 그에 의해 형질전환된 대장균을 배양하여 신규한 내열성 재조합 UXPase 효소를 용이하게 대량생산하는 방법을 제공하는 것이다.본 기술은 고온성 박테리아인 Thermus caldophilus GK24로부터 당핵산염 복합효소를 분리정제하고, 이로부터 제한효소 절단, cosmid library 제조, transformation, southern hybridization 및 subcloning을 통하여 UXPase 유전자를 클로닝한 다음, pGLB와 UXPase를 발현시키기 위한 프라이머 유전자를 사용하여 PCR을 수행한 후, 발현벡터에 삽입하고 대장균에 도입하여 UXPase 발현시켜 정제하고, 정제된 UXPase의 기질특이성과 염 및 온도에 따른 재조합 UXPase의 활성을 측정하는 기술이다당핵산염 합성효소는 삼인산염(NTP)과 hexose 1-P로부터 NDP-hexose를 합성하고 pyrophosphate를 방출하는 가역반응을 촉매한다. 핵산염 합성효소에 의해서 합성된 당핵산염(NDP-hexose)은 효소를 이용하여 연속적으로 glycosyltransferasereaction의 기질로서 사용될 수 있다. 효소를 이용하여 생물학적 활성이 있는 각종 복합 탄수화물 및 탄수화물 유도체를 합성하기 위해서는 전구체인 NDP-hexose를 합성하는 효소가 필요하며, 특히 효소의 정제를 쉽게 하기 위하여 고온에서 안정한 내열성 효소가 필수적이다. 이에 본 기술에서는 주반응으로 UDP-xylose를 합성하고 부반응으로 다양한 당핵산염을 합성할 수 있는 신규한 내열성 UXPase 효소를 제공한다. 본 기술에서의 UXPase의 분자량은 160kDa 이었는데, 아미노산 서열로부터 계산된 분자량(38kDa)과 비교하였을 때 tetramer로서 작용함을 알 수 있다. 또 UXPase의 기질특이성을 조사한 결과 UTP와 xylose 1-phosphate외에 다양한 기질에 기질특이성을 나타냈다.한편, 본 기술의 UXPase는 2가 양이온을 cofactor로서 필요로 한다. UXPase를 Mg2+, Co2+, Ni2+, Mn2+의 존재하에 활성을 측정한 결과, 특히, Mn2+을 사용했을 때에는 Mg2+보다 높은 활성을 나타냈다(Mn2+ ＞ Mg2+ ＞ Ni2+ ＞ Co2+). 또한, UXPase는 80℃에서 1시간동안 100%의 활성을 유지하여 열에 매우 안정함을 알 수 있다. 그러나 90℃ 이상의 온도에서는 불안정하여, 95℃에서 15분의 half-life를 나타냈다. 본 기술에 의하면 상기 신규한 재조합 UXPase를 대량생산할 수 있으므로, 탄수화물 공학에서 기능적 생당체 합성 등 여러 당핵산염을 필요로 하는 생물공학 산업상 매우 유용한 기술인 것이다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-18
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일반기술
보건·의료 > 의약품 제제 개발 기술
사람 파필로마바이러스(HPV) 16형 E6 단백질의 전사활성능에 의한 암화능을 억제하는 항암제의 효능 검색방법 및 스크리닝 방법에 관한 것으로, 특히 자궁경부암을 유발하는 HPV 16형 E6 단백질의 전사활성능을 검색하는 프로모터 활성 검색용 pRSV-luc 플라스미드가 도입된 SiHa/pRSV-luc 세포주에 항암제를 처리한 후 HPV 16형 E6단백질의 전사활성능을 검색함으로써 항암제의 기능 검색방법 및 스크리닝 방법이다. 즉, HPV 16형 E6 단백질에 의해 활성화되는 프로모터 유전자를 4종의 바이러스인 RSV, SV40, HIV, CMV으로부터 얻고, 이 프로모터 유전자와 리포터 유전자로 루시퍼라제 단백질을 암호화하는 유전자를 연결하여 4종의 플라스미드를 제조한 후, 자궁경부암 세포주 SiHa세포에 도입하여 안정한 세포주 SiHa/pRSV-luc 세포주를 제조하고 이 세포주에 여러 종의 항암제를 처리하여 HPV 16형 E6의 발현을 검색함으로써 자궁경부암에 대한 항암제의 효능을 검색하는 방법이다.이 세포주를 항암제로 처리한 후 HPV 16형 E6 단백질의 발현여부만을 검색하는 간단한 공정으로 자궁경부암에 대한 항암제의 치료 효능을 검색하고 나아가 이 세포주를 이용하여 자궁경부암 등의 항암제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다자궁경부암은 자궁암의 90%이상을 차지하고 한국 여성에서 발생 및 사망빈도가 가장 높은 악성종양이다. 한편, HPV 16형과 18형은 남녀 생식기, 구강, 피부 등에서 악성종양과 관련되고 특히 여성자궁암의 90% 이상을 차지하는 자궁경부암을 일으키는 주요인자로 작용하는 것으로 밝혀졌으며, HPV 16형과 18형 관련 암 발생에 중추적인 역할을 할 것으로 예상되는 유전자는 E6과 E7로서, 최근 E6 단백질은 암억제 단백질 등과의 결합하는 기능 이외에 여러 유전자의 프로모터 전사활성능을 증가 또는 억제하는 기능이 알려지고 있다. 따라서 이 E6 단백질의 전사활성능과 암화 기전은 HPV에 의한 발암기작 연구 및 효과적인 자궁경부암 항암치료제를 개발하는데 있어 매우 중요하다고 할 수 있다. 이에 HPV 16형E6 단백질의 암화능과 관련된 전사활성능을 분석할 수 있는 pRSV-luc 플라스미드를 선별하고 자궁경부암 세포주인 SiHa에 이입시켜 전사활성이 증가되는 안정한 세포주 SiHa/pRSV-luc를 얻었다. 항암제인 카보플라틴, 마이토마이신 C, 시스플라틴을 처리한 후 전사활성능의 변화를 검색한 결과, 세 항암제 모두가 pRSV-luc 전사만을 일관성있게 억제하였으며, 또 E6의 발현에 미치는 항암제의 영향을 검색한 결과 상기 세 항암제 모두 E6의 발현을 억제하는 것으로 나타나, 본 기술이 매우 뛰어난 자궁경부암 항암제 효능검색 및 스크리닝 방법임을 알 수 있다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-06-23
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일반기술
보건·의료 > 의약품 제제 개발 기술
인간 알파s1 카제인을 발현시키는 플라스미드를 제조하고, 이 플라스미드를 대장균에 형질전환시킨 후 형질전환체로부터 모유의 주단백질인 카제인 중의 하나인 인간 알파s1 카제인의 재조합 단백질을 수득한다. 사람 유선 cDNA 라이브러리로부터 알파s1 카제인 유전자를 분리하여 PCR로 증폭한 후 플라스미드 pET-22b(+)에 클로닝하여 플라스미드 pHαs1C1 및 pHαs1C2를 제작한 다음, 플라스미드로 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시키고 이를 배양하여 발현된 재조합 인간 알파s1 카제인 중 pHαs1C2에 의해 발현된 재조합 인간 알파s1 카제인을 고정화 금속친화성 크로마토크래피로 정제한다.카제인은 모유에 함유되어 있는 단백질중 40%를 차지하고, 분해물은 오피오이드, 항혈액응고성, 항고혈압성 및 면역조절기능을 제공한다. 포유류의 젖에 함유되어 있는 카제인은 α, β, κ 형태로 구분되는데, 우유에는 알파형이 50%이상 함유되어 있는 반면, 사람의 경우에는 그 양이 적어 종래에는 알파형이 결여된 것으로 알려져 있었다. 1994년에 사람 모유에 알파s1 카제인이 0.06% 함유되어 있음이 보고된 후, 유전자도 클로닝되었으나 그 기능은 아직까지 보고된 바 없었다. 본 기술의 가장 큰 특징은 인간 알파s1 카제인을 발현시키는 두 가지 플라스미드중 pHα s1C2는, 카르복시 말단에 6개의 히스티딘이 붙은 재조합 인간 알파s1 카제인을 발현시키도록 제작하여, 고정화 금속친화성 칼럼크로마토그래피인 Ni-NTA 칼럼크로마토그래피로 용이하게, 그리고 순수하게 정제된 인간 알파s1 카제인을 얻을 수 있는 뛰어난 효과가 있다는 것이다. 본 기술에 의하면 재조합된 인간 알파s1 카제인을 효율적으로 발현시킬 수 있으므로, 사람 모유의 알파s1 카제인 기능 연구 및 생물의약산업상 매우 유용한 것으로 판단된다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-17
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일반기술
생명과학 > 식물자원
슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD; superoxide dismutase)와 아스코르베이트 퍼옥시다제(APX; ascorbate peroxidase)를 이용한 환경스트레스 내성식물의 개발에 관한 것이다. 본 기술의 목적은 식물체에 환경스트레스에 대한 저항성을 부여하기 위해 SOD 및 APX를 엽록체에 동시 발현시킨 식물체를 개발하고자 하는 것이다. 본 기술은 완두에서 분리한 SOD의 cDNA와 APX의 cDNA를 조작하여, 카나마이신에 저항성을 갖고 있는 담배에 SOD를 형질전환시키고 이어서 상기 형질전환 담배에 바스타를 선별표지로 하여 APX를 재도입하거나, 반대로 카나마이신에 대한 저항성을 가진 담배에 APX를 먼저 형질전환시킨 뒤 바스타를 선별표지로 사용하여 SOD를 재도입하여 이중으로 형질전환시킴으로써, 환경스트레스에 대한 저항성 담배를 제조하는 방법이다. 본 기술에 의하면 SOD와 APX를 동시에 엽록체에서 발현시킴으로써 환경 스트레스에 보다 저항성을 갖는 식물체를 개발할 수 있다. 따라서 이러한 SOD 및 APX를 엽록체에서 동시에 발현시키는 방법은 점차 악화되고 있는 환경에서 생산성을 유지할 수 있는 식물체의 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다SOD와 APX는 활성 산소종의 제거와 수산화 라디칼의 예방에 관여하는 항산화 효소이다. SOD는 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼을 과산화수소(H2O2)로 전환시키는 효소이고, APX는 아스코르베이트를 전자공여체로 사용하여 H2O2를 물로 전환시키는 효소이다. 한편, 식물체의 엽록체에서는 비교적 높은 농도의 산소가 상존하며, 빛에너지를 이용하여 물을 분해하는 과정에서 발생되는 전자의 에너지를 활용하기 위한 전자전달계가 존재하고 있어 다양한 산화적 스트레스에 민감하게 반응한다. 따라서 엽록체의 항산화능력을 높일 수 있다면 환경스트레스 조건에서도 식물의 생산성을 유지시킬 수 있을 것으로 기대된다. 이에 본 기술에서는 식물체에 SOD와 APX를 동시에 발현시켜 항산화능력을 높여줌으로써 산화적 스트레스에 저항성을 갖도록 하는 방법을 제공한다. 본 기술에서는 SOD와 APX를 완두에서 얻었으며, 형질전환의 대상이 되는 식물체는 담배로 결정하였다. 본 기술의 이중형질전환 식물체는 산화적인 스트레스를 야기하는 파라킷(paraquat)을 처리하는 경우, SOD 및 APX가 이중발현하는 식물체의 잎의 가시적인 손상이 비형질전환 식물체의 손상보다 매우 적게 나타나 본 기술에 의한 이중 형질전환 식물체가 산화적 스트레스에 보다 저항성이 있는 것을 알 수 있었으며, 더욱이 중금속인 카드늄에도 내성을 나타내어 엽록체에 과발현된 SOD와 APX는 중금속에 의해 유도되는 산화적 스트레스를 경감시키는 효과가 있었다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-18
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일반기술
생명과학 > 기타 생물공정·대사공학
라넬라 아쿠아틸리스 유래의 레반수크라제를 이용하여 설탕과 알콜로부터 알킬베타-디-프럭토시드를 생산하는 방법으로서, 높은 알콜농도를 유지하는 수용액상에 레반수크라제를 도입하여 가수분해 반응을 억제함으로써 알킬베타-디-프럭토시드의 생산수율을 향상시키는 것이며, 아울러 수용액상의 알콜 종류를 다양화하여 여러 종류의 알킬베타-디-프럭토시드를 생산하는 방법을 제공한다. 상술하면 일정량의 설탕을 용해한 메스(4-모폴린에탄설포닉산) 완충용액에 라넬라 아쿠아틸리스(Rahnella aquatilis)로부터 유래된 레반수크라제와 여러 알콜을 첨가하여 알킬베타-디-프럭토시드의 양을 측정하고, 알콜농도를 높인 후 저온에서 반응을 실시하여 얻은 알킬베타-디-프럭토시드의 양을 측정,비교하여 생산수율을 향상시키는 방법이다.본 기술에 따르면 메탄올, 에탄올, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등과 같은 여러 가지 알콜을 사용하여 알킬베타-디-프럭토시드를 제조할 수 있으며 , 알콜농도는 높이고 반응 온도는 저온으로 유지하여 베타-디-프럭토시드를 고수율로 생산할 수 있다베타-디-프럭토시드는 알킬글루코시드의 대체제로 사용이 가능한데, 알킬 글루코시드는 의약품, 식품, 화장품 등에 사용되고 있는 당 계면활성제의 일종인 알킬 글루코시드 지방산에스테르의 원료물질로 이용되고 있다. 특히 글루코오스에 비해 프럭토오스는 녹는점이 낮고, 수분 및 유기용매에 대한 용해도가 높기 때문에 알킬 프럭토시드 또한 알킬 글루코시드에 비해 기능성이 높을 것으로 예상되고 있다. 한편, 레반수크라제는 수용액상에서 설탕을 기질로 사용하여 높은 분자량의 수용성 프럭토오스 고분자 물질을 합성하는 효소이다. 본 기술에서는 레반수크라제에 의한 프럭토오스 유도체중 알킬베타-디-프럭토시드의 수율을 높이기 위해서, 반응온도를 낮추어 효소의 안정성을 크게 증가시킴으로써 고농도의 알콜에서도 효소활성이 유지되도록 하였다. 다양한 알콜을 사용하여 그 반응성을 조사한 결과, 히드록실기가 2개 이상인 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세롤이 메탄올이나 에탄올에 비해 반응성이 훨씬 좋은 것으로 나타났으며, 또한 메틸 베타-디-프럭토시드의 생성수율을 높이기 위하여 메탄올의 농도를 높여 반응한 실험결과 반응속도는 저하되었으나 수율은 크게 증가하는 양상을 보였다.다양한 알콜을 고농도로 포함하는 수용액에 설탕을 첨가하고 레반수크라제와 저온에서 반응시킴으로써, 알킬베타-디-프럭토시드를 고수율로 생산할 수 있으므로 식품, 의약품 및 화장품 산업상 대단히 유용한 기술이다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-17
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일반기술
생명과학 > 미생물자원
토양으로부터 분리된 곰팡이 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) FM-F-93에 의해 생산된 항암물질 GERI-BP002A로서, 미생물을 배양,여과하여 수득된 균체를 아세톤 및 에틸 아세테이트로 차례로 추출하여, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 및 HPLC를 이용하여 GERI-BP002A를 정제한 다음, 인간 암세포주들을 이용하여 그 항암활성을 확인한 결과 강력한 항암효과를 가지는 것으로 나타났다암의 발생률은 문명이 발달함에 따라 증가하고 있음에도 불구하고 암 발생의 근본원인을 지적할 수 있을 정도로 암의 원인이 규명되어 있지는 않다. 암환자의 치료법에는 외과적 수술, 방사선 치료, 항암물질 투여에 의한 화학요법 등이 있지만 대부분 조기 암환자나 특정 암에만 국한되어 암으로 인한 사망은 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 이에 토양에서 분리된 아스퍼질러스속 곰팡이가 생산하는 물질 GERI-BP002A가 항암 활성을 나타냄을 발견하여 신규 항암제로서의 용도를 제공한다. GERI-BP002A의 생체 독성시험에서 ICR 생쥐에 복강내 주사하였을 때, LD는 500mg/kg 체중으로 나타났으며, 한편 GERI-BP002A의 항암활성을 인간 암세포주들인 A549(human non-small cell lung), SKOV-3(human ovarian), HCT-15(human colon), XF-498(human CNS), SKMEL-2(human melanoma)를 이용하여 측정한 결과, 강력한 항암효과를 확인하였다
- 보유기관
- 한국과학기술연구원
- 등록일
- 2001-05-17
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일반기술
보건·의료 > 원료의약 대량제조 기술
신호전달체계에 관여하는 효소들의 억제제 또는 활성인자로서 유용한 D-만노피라노스 화합물에 관한 것으로, 정신질환 치료제로 쓰이는 리튬은 신호전달체계에 관여하는 효소들의 억제 또는 활성에 관련된 것으로 알려지고 있고, 또 리튬은 이노시톨 대사과정에서 포스파타아제를 억제하는 효과가 있다고 보고된 바 있어, 이러한 신호전달체계에 관여하는 효소들의 억제제 또는 활성인자로서 유용한 이노시톨 유사체를 개발하여 질병치료에 사용하고자 하는 것이다.이노시톨 구조의 시클로헥산 골격에서 탄소원자 하나를 산소원자로 치환시킨 만노피라노스 화합물이 기존의 인산화 이노시톨 유사체와는 다른 특이한 효소 활성을 나타낸다는 것을 밝혀내고, D-만노피라노스 화합물과 그의 1-메탄포스포네이트 또는 1-포스페이트에 지방산을 치환시킨 지방산 유도체를 제공한다. 본 화합물에 의한 세포내의 이노시톨-1,4,5-삼인산의 조절은 정신질환치료제 등 약학적인 측면에서 매우 중요할 것으로 기대된다.암세포 성장 저해와 관련된 D-3-디옥시-3-아지도-마이오-이노시톨, 소염효과가 있는 이노시톨-1,2,6-삼인산과 포스포리파제 C의 억제효과가 있는 이노시톨-4-인산-1-포스포네이트의 지방산 화합물 및 천연 이노시톨 인산의 화학적 합성방법 등이 보고되어 있다. 세포막 구성성분의 하나인 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트는 포스포리파제 C 에 의하여 디아실글리세롤(DAG)과 D-마이오-이노시톨-1,4,5-삼인산 등 두 개의 이차전달체로 전화되며, 이때 생성된 D-마이오-이노시톨-1,4,5-삼인산은 세포내의 칼슘의 동적 평형에 관계된다. 즉, 세포내의 이노시톨-1,4,5-삼인산의 조절이 신호전달체계에서 매우 중요할 것으로 기대된다. 본 기술에 따른 인산화 이노시톨 유사체는 기존의 인산화 이노시톨 유사체와는 매우 다른 구조 및 특이한 효소활성을 나타낸다. 즉, 이노시톨 구조의 시클로헥산 골격에서 탄소원자 하나는 산소원자로 치환하여 시클로헥산 고리의 구조를 변화시켰을 뿐만 아니라, 6-위치의 히드록실시를 변화시켰고, 본 화합물은 천연 D-마이오-이노시톨 유사체와는 입체적으로 거울상 이성질체의 구조를 가지며, 생물 활성의 경우 본 화합물중 (1-디옥시-4,6-비스포스포릴-β-D-마노피라노실)메틸포스포네이트는 3-키나아제를 선택적으로 저해하며, 포스파타제에 대한 억제효과도 있다본 화합물들의 생리활성 효과에 대해서는 세포내의 칼슘이온 용출, 여러 가지 이노시톨 관련 효소들의 활성 및 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 3-키나아제 효소의 활성 등을 측정하여 확인하였다
- 보유기관
- 포항공과대학교
- 등록일
- 2001-05-17
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